车晓菲，王红志,2 ，汪 令,2，赵双志 ，王 露,2 ，赵兵令,2★

（1.河北维尔利动物药业集团有限公司 050200；2.河北省中兽药产业技术研究院 050200；3.河北省功能性添加剂技术创新中心 050200）

清肺排毒汤由《伤寒杂病论》中的麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤、五苓散等经典方优化组合而来，在抗击新冠疫情中发挥了重要作用。兽用清肺排毒汤是受清肺排毒方对中兽药的启发，考虑到相应病症对组方进行调整而得[1]。其组方在清肺排毒汤的基础上，结合了普济消毒饮[2]、宣白承气汤[3]、苓桂术甘汤[4]等经典方剂，由麻黄、黄芩、连翘、大黄、厚朴、山药、白术、鱼腥草、石膏等24种药材按规定工艺制备而成，用于黑肺、烂肺、肺热、痰热壅肺证。考虑到兽用清肺排毒汤组方复杂，为科学有效的控制产品质量，我们通过检索相关质量标准，制定了如下研究方案：（1）参考《中国兽药典》[5]中藿香正气口服液的“鉴别”方法，通过TLC法定性鉴别厚朴。（2）参考《中国兽药典》中大黄药材的“鉴别”方法，通过TLC法定性鉴别大黄。（3）参考《中国兽药典》中黄芩药材的“含量测定”方法，测定黄芩苷含量。（4）参考《中国兽药典》麻杏石甘口服液的“含量测定”方法，测定盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的总含量。（5）参考《中国兽药典》中连翘药材的“含量测定”方法，测定连翘苷含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260 Infinity II高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），DAD检测器，OpenLab CDS VL 工作站 ；AUW120D型电子天平（日本SHIMADZU公司）；DK-98-Ⅱ电子恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；ZF-1型三用紫外分析仪（上海市安亭电子仪器厂）。

1.2 对照品与试剂

厚朴酚对照品（批号110729-202015 含量99.0%）；和厚朴酚（批号19032102 含量99.96%）；厚朴对照药材（批号121285-201303）；大黄对照药材（批号120984-201202）；大黄酸对照品（批号110757-201607 含量99.3%）；黄芩苷对照品（批号110715-201821 含量95.4%）；盐酸麻黄碱对照品（批号171241-201809 含量100.0%）；盐酸伪麻黄碱对照品（批号171237-201510 含量99.8%）；连翘苷对照品（批号110821-201816 含量95.1%），上述对照品及对照药材除和厚朴酚购于成都普菲德生物技术有限公司外，均来自中国食品药品检定研究院。HPLC法中，甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为娃哈哈水。其他试剂均为分析纯。

1.3 药材与样品制备

1.3.1 药材

麻黄、黄芩、连翘、大黄、厚朴、山药、白术、鱼腥草、石膏、苦杏仁、水半夏、瓜蒌、生姜、茯苓、射干、紫苑、桑白皮、枳壳、陈皮、丹参、升麻、马鞭草、仙鹤草、桔梗等均采买于河北华都药业有限公司，质量均符合《中华人民共和国兽药典》2020版（二部）的有关规定。

1.3.2 样品制备

1.3.2.1 兽用清肺排毒汤样品制备：麻黄30g，连翘45g，大黄30g，厚朴30g，山药30g，白术30g，鱼腥草45g，石膏150g，水半夏45g，瓜蒌45g，生姜30g，茯苓45g，射干45g，紫菀30g，桑白皮45g，枳壳30g，陈皮30g，丹参45g，升麻45g，马鞭草30g，仙鹤草45g，桔梗30g，共计22味，加水煎煮，提取2次。第一次2h加水8倍量，煮沸后加入黄芩45g，苦杏仁30g，第二次提取1h，加水6倍量。煎煮过程中收集蒸馏液,药液合并滤过，减压浓缩，冷藏静置24h，过滤，滤液加水至1000mL，即得。

1.3.2.2 厚朴对照药材煎煮液：取厚朴对照药材2g，加水30mL，加热回流3h，滤过，滤液浓缩至5mL，备用。

1.3.2.3 药材单提液溶液：大黄、黄芩、麻黄、连翘等药材各自按“1.3.2.1”项下相关规定制备。

1.3.2.4 阴性样品制备：除目标药材外，其余药材按“1.3.2.1”制备工艺进行处理。

2 试验方法与结果

2.1 TLC定性鉴别

2.1.1 厚朴的薄层鉴别

参考藿香正气口服液进行研究：取兽用清肺排毒汤（批号：20210401）样品20mL，用石油醚（30℃～60℃）置分液漏斗中振摇提取2次，每次加入25mL，合并石油醚液，低温蒸干（50℃以下），残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。取厚朴对照药材煎煮液，同法制成对照药材溶液。另取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2020版中国兽药典附录0502）试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸（17:3:0.4）为展开剂，展开，取出，晾干。显色：喷以5%香草醛硫酸溶液，在100℃加热至斑点显色清晰。结果：供试品色谱中，在与厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，分离度良好；阴性样品无干扰；对照药材溶液上下沿斑点Rf值未达到要求，不作为参考依据。结果见图1：

图1 兽用清肺排毒汤中厚朴的TLC图

结果表明：该方法中厚朴酚、和厚朴酚作为目标成分专属性符合要求，可作为厚朴的鉴别依据。

2.1.2 大黄的薄层鉴别

取兽用清肺排毒汤（批号：20210401）样品20mL，蒸干，干膏加甲醇20mL，超声处理10min进行提取，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水10mL使全部溶解，再加盐酸1mL，加热回流30min，立即冷却，转移至分液漏斗中，用乙醚分2次振摇提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。对照药材、对照品参照《中国兽药典》中大黄药材的薄层鉴别系统进行检验。结果：供试品色谱中，在与大黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与大黄酸对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点。同时，进行大黄阴性样品、大黄药材的检测。结果见图2：

图2 兽用清肺排毒汤中大黄TLC图

结果表明：阴性样品无干扰，该方法专属性符合要求；供试品及药材斑点清晰，可作为大黄的鉴别依据。

2.2 含量测定

2.2.1 黄芩含量测定（以黄芩苷含量计）

2.2.1.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）；流速：1.0mL/min；检测波长：280nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。柱温：室温；进样量：10μL。

2.2.1.2 对照品溶液及供试品溶液的制备

对照品溶液的制备：取在60℃减压干燥4h的黄芩苷对照品约15mg，精密称定，加甲醇稀释250倍，制成每1mL约含60μg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密量取供试品2mL，置25mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。同时，按供试品溶液的制备方案，处理黄芩阴性样品以及黄芩单提液。

上述对照品溶液及供试品溶液过0.45μm滤膜，滤液装入液相小瓶，备用。

2.2.1.3 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、黄芩阴性样处理液、黄芩单提液处理液各10μL，按“2.2.1.1”项下规定的色谱条件进行测定，考察此方法专属性是否符合要求。结果见图3。

图3 黄芩含量测定

结果表明：阴性样品对黄芩苷主峰无干扰，该方法专属性符合要求。

2.2.1.4 线性关系考察

精密称取在60℃减压干燥4h的黄芩苷对照品15.08mg（含量95.4%），置50mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为对照品储备液。精密量取6份对照品储备液，每份5.0mL，分别置于200mL、100mL、50mL、25mL、10mL、5mL的容量瓶中，依次加甲醇定容，摇匀，作为对照溶液。依次精密量取对照溶液10μL，按“2.2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积数值。以对照品浓度作为横坐标（X，μg/mL）,黄芩苷色谱峰的峰面积作为纵坐标（Y，mAU*S），进行线性回归计算，考察线性关系范围。

回归方程为：Y=34.568X+53.18 （R2=0.9996）

结果表明：该方法在黄芩苷7.1932～287.73μg/mL的浓度范围内线性关系符合要求。

2.2.1.5 准确度考察

精密量取“2.2.1.4”项下制备的对照储备液5.0mL，置25mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为对照溶液。取样品3瓶（批次：20210401）作为供试品，每瓶取样2.0mL组成1组。第一组加对照溶液1.0mL，第二组加对照溶液2.0mL，第三组加对照溶液5.0mL，按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1.1”项下色谱条件下测定。记录峰面积并计算回收率，考察方法的准确度。测得黄芩苷的回收率均在98%～102%之间。详见表1：

表1 黄芩苷回收率测定结果统计表

结果表明该方法准确度符合要求。

2.2.1.6 精密度考察

取同一液相小瓶中的供试品溶液，按规定的色谱条件，连续进样6次，记录黄芩苷色谱峰峰面积，计算峰面积的RSD值，考察此方法的精密度。

结果测得黄芩苷色谱峰峰面积RSD值为：0.16%，表明该方法精密度良好，符合要求。

2.2.1.7 重复性考察

取同一批样品3瓶（批次：20210401）作为供试品，第一组分别取样1.0mL，第二组分别取样2.0mL，第三组分别取样3.0mL，共计9份样品。按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1.1”项下色谱条件下测定，计算黄芩苷的含量，考察方法的重复性。结果详见表2.

表2 黄芩苷含量测定结果统计表

结果表明：该方法测定黄芩苷含量重复性良好，符合要求。

2.2.1.8 稳定性考察

取同一液相小瓶的供试品溶液，自其第一次进样起计时，间隔2h,4h,8h,12h,18h,24h各进样1次，记录黄芩苷色谱峰峰面积，并计算其RSD值，考察方法的稳定性。

结果测得黄芩苷色谱峰峰面积RSD值为：0.22%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.2 麻黄含量测定（以盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的总量计）

2.2.2.1 色谱条件

色谱柱：C18柱；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）（3:97）；检测波长：207nm；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于4000；柱温：室温；进样量：10μL。

2.2.2.2 混合对照品及供试品溶液的制备

混合对照品溶液的制备：分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品约10mg，精密称定，置同一50mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液定容，摇匀；精密移取5.0mL，置50mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密量取供试品10mL，置150mL碘量瓶中，加浓氨试液10mL，精密加入三氯甲烷50mL，称定重量，超声处理20min，时时振摇，放冷，加三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，精密量取下层三氯甲烷液25mL，加盐酸乙醇溶液（1→20）4mL，减压回收三氯甲烷至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，转移至25mL量瓶中，容器分次洗涤，洗液并入同一量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液定容，摇匀，即得。同时，按供试品溶液的制备方法，处理麻黄阴性样品以及麻黄单提液。

上述溶液过0.45μm滤膜，滤液装入液相小瓶，备用。

2.2.2.3 专属性考察

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、麻黄阴性样品处理液、麻黄单提液处理液各10μL，按“2.2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，对专属性进行考察。结果见图4。

图4 麻黄含量测定

结果表明：阴性样品w对测定无干扰，该方法专属性符合要求。

2.2.2.4 线性关系考察

精密称取盐酸麻黄碱对照品11.06mg（含量100.0%）、盐酸伪麻黄碱对照品10.39mg（含量99.8%），置同一50mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容摇匀，作为混合对照品储备液。精密量取储备液5.0mL，分别置200mL、100mL、50mL、25mL、10mL、5mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液定容摇匀，作为对照溶液。按“2.2.2.1”项下色谱条件进样测定，分别记录盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的峰面积。以浓度作为横坐标（X，μg/mL）,峰面积作为纵坐标（Y，mAU*S），进行线性回归计算。

盐酸麻黄碱的回归方程为：Y=20.43X+8.3229 （R2=0.9999）

盐酸伪麻黄碱的回归方程为：Y=20.452X-4.5099（R2=0.9995）

结果表明：该方法在盐酸麻黄碱浓度为5.5300～221.20μg/mL、盐酸伪麻黄碱浓度为5.1846～207.38μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2.5 准确度考察

精密量取“2.2.2.4”项下对照储备液5.0mL，加0.1mol/L盐酸溶液稀释并定容至50mL，作为混合对照溶液。取3瓶样品（批次：20210401）作为供试品，每瓶平行取样3份，每份精密量取10.0mL。3瓶各取1份组成一组，第一组加混合对照溶液1.0mL，第二组加混合对照溶液2.0mL，第三组加混合对照溶液5.0mL，分别按“2.2.2.2”、“2.2.2.1”项下规定进行测定。记录峰面积并计算回收率，考察方法的准确度。测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的回收率均在98%～102%之间。详见表3、表4：

表3 盐酸麻黄碱回收率测定结果统计表

表4 盐酸伪麻黄碱回收率测定结果统计表

结果表明：此方法中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的回收率良好，准确度均符合要求。

2.2.2.6 精密度考察

取同一液相小瓶的供试品溶液，连续进样6次，记录盐酸麻黄碱色谱峰、盐酸伪麻黄碱色谱峰的峰面积，计算峰面积的RSD值，考察方法的精密度。

结果测得盐酸麻黄碱峰面积RSD值为：0.12%，盐酸伪麻黄碱峰面积RSD值为：0.19%，表明该方法精密度良好。

2.2.2.7 重复性考察

取同一批样品（批次：20210401）3瓶，分别取样，分组如下：第一组取样量5.0mL，第二组取样量10.0mL，第三组取样量15.0mL，按“2.2.2.2”、“2.2.2.1”项下规定进行测定，分别计算含量及RSD值，考察方法的重复性。结果详见表5、表6、表7。

表5 盐酸麻黄碱含量测定结果统计表

表6 盐酸伪麻黄碱含量测定结果统计表

表7 盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱总量测定结果统计表

结果表明：该方法测定盐酸麻黄碱含量、盐酸伪麻黄碱含量及两者的总量重复性良好。

2.2.2.8 稳定性考察

取同一液相小瓶的供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h，18h，24h进样1次，记录盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的峰面积，并计算峰RSD值，考察该方法的稳定性。

结果测得盐酸麻黄碱峰面积RSD值为：0.21%，盐酸伪麻黄碱峰面积RSD值为：0.28%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.3 连翘含量测定（以连翘苷计）

2.2.3.1 色谱条件

色谱柱：C18柱；流动相：乙腈-水（25:75）；检测波长：277nm；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。柱温：25℃；进样量：10μL。

2.2.3.2 对照品溶液及供试品溶液的制备

对照品溶液的制备：取连翘苷对照品约20mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密量取供试品5mL，置25mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。同时，按供试品溶液的制备方案，处理连翘阴性样品以及连翘单提液。

上述对照品溶液及供试品溶液过0.45μm滤膜，滤液装入液相小瓶，备用。

2.2.3.3 专属性考察

按“2.2.3.1”、“2.2.3.2”项下规定，进行对照品溶液、供试品溶液、连翘阴性样处理液、连翘单提液处理液测定，记录色谱图，对专属性进行考察。结果见图5。

图5 连翘含量测定

结果表明，阴性样品对测定无干扰，该方法专属性符合要求。

2.2.3.4 线性关系考察

精密称取连翘苷对照品20.12mg（含量95.1%），加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，作为对照品储备液。精密量取储备液6份，每份1.0mL，依次加甲醇稀释至100mL、50mL、25mL、10mL、5mL、2mL，作为对照溶液，按“2.2.3.1”、“2.2.3.2”进行测定，记录峰面积。以浓度作为横坐标（X，μg/mL）,峰面积作为纵坐标（Y，mAU*S），进行线性回归计算。

回归方程为：Y=6.3554X-9.7904 （R2=0.9997）

结果表明：该方法在连翘苷19.1341～956.706μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2.3.5 准确度考察

精密量取“2.2.3.4”项下对照储备液1.0mL，加甲醇稀释并定容至10mL，作为对照溶液。取同一批（批次：20210401）3瓶样品作为供试品，每瓶平行取样3份，每份精密量取2.0mL。3瓶各取1份组成1组，第一组加对照溶液1.0mL，第二组加对照溶液2.0mL，第三组加对照溶液5.0mL，按“2.2.3.2”、“2.2.3.1”项下规定进行测定。记录9份样品的连翘苷峰面积，计算其回收率，考察方法的准确度。结果详见表8。

表8 连翘苷回收率测定结果统计表

结果测得连翘苷的回收率均在98%～102%之间，表明该方法准确度符合要求。

2.2.3.6 精密度考察

取同一液相小瓶的供试品溶液，连续进样6次，记录连翘苷峰面积，计算其RSD值，考察此方法的精密度。

结果测得连翘苷峰面积RSD值为：0.22%，表明该方法精密度良好。

2.2.3.7 重复性考察

取同一批样品（批次：20210401）3瓶，分别取样。第一组分别取样5.0mL，第二组分别取样10.0mL，第三组分别取样15.0mL，置于50mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容。按“2.2.3.1”项下规定的进行测定，计算连翘苷的含量及RSD值，考察方法的重复性。结果详见表9。

表9 连翘苷含量测定结果统计表

结果表明：该方法测定连翘苷含量重复性良好。

2.2.3.8 稳定性考察

取同一液相小瓶的供试品溶液，自第一次进样计时，分别于2h,4h,8h,12h,18h,24h进样1次，记录连翘苷峰面积并计算RSD值，考察方法的稳定性。

结果测得连翘苷峰面积RSD值为：0.27%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3 样品测定

取6批样品，每批平行样个数n=3，分别按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”项下规定制备供试品溶液，并按相应色谱条件进行测定，计算含量。结果见表10。

表10 各成分含量测定结果

3 讨论

兽用清肺排毒汤组方中有24味药材，作为大组方制剂，在制定质量标准时实验条件的筛选困难重重。在进行TLC薄层色谱条件的摸索中，对山药、白术、鱼腥草也进行尝试，除药材方法外，山药尝试了健脾肥儿口服液系统[6]、健胃消食片系统[7]；白术尝试了五味健脾合剂[8]、五苓散系统[9]；鱼腥草尝试了鱼腥草配方颗粒系统，但因重现性差、阴性样品干扰、目标成分与工艺不匹配等因素，未能筛选出符合要求的实验条件。

中药复方制剂中化学成分复杂，所以其质量评价应进行多组分含量检测。在兽用清肺排毒汤处方中，黄芩具有清热燥湿，泻火解毒的功效；麻黄具有解表散寒，宣肺平喘，利水消肿的功效；连翘具有清热解毒，消肿散结的功效。查阅文献[10-15]发现三者在其他制剂中常作为目标成分，HPLC分析条件较成熟，经方法学验证，筛选出了适用于黄芩苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、连翘苷含量测定的实验条件。

中医药理论强调的是整体观念。通过对兽用清肺排毒汤的检验方法研究，使得我们对大组方制剂的质量标准建立有了进一步的认知，将继续加深中药复方制剂药效与质量之间的关系探索。

4 结论

兽用清肺排毒汤是优秀的中兽医药工作者受“清肺排毒方”启发，强化中兽医药经书经方的学习与研究，结合经典方剂而制定。为了控制产品质量，对厚朴、大黄的TLC定性鉴别和黄芩、麻黄、连翘的HPLC含量测定进行研究，结果表明此方法符合“兽药质量标准分析方法验证指导原则”要求，可为兽用清肺排毒汤提供有效的质量控制。