廖旺姣，钟雅婷，韦 维，邹东霞，罗 辑

（广西壮族自治区林业科学研究院 广西特色经济林培育与利用重点实验室 广西林业有害生物天敌繁育工程技术研究中心，广西南宁 530002）

香花油茶（Camellia osmantha）为山茶属短柱茶组新物种，具有早熟、果量多、出籽率高和抗逆性强等特点，树型美观，花带香气，具有独特的表型性状[1]。2012年，在广西南宁发现该物种，之后逐步在广西推广种植。目前，香花油茶的研究主要集中在苗木快速繁育[2-4]、种质资源评价[5]、栽培[6]、生理[7-8]及叶片和果壳的综合利用[9-11]等方面，针对病虫害的报道较少。已报道的香花油茶苗期炭疽病病菌为Col⁃letotrichum fructicola[12]。单一作物连片种植易引发病害流行[13]。炭疽病是危害香花油茶叶片的主要病害之一，尤其是在苗期；苗期植株间距小，苗圃湿度大，通风透气性差。炭疽病病菌存在明显的致病力分化现象[14-15]，同一地区不同炭疽病菌株的致病力存在一定差异，不同地区同一炭疽病菌株的致病力也存在一定差异[16]。油茶炭疽病病菌也存在类似现象。李扬等[17]研究显示，炭疽病原Colletotrichum ca⁃melliae对湘林1 号、湘林69 号和湘林89 号等12 个油茶（Camellia oleifera）品系叶片的致病力存在差异。不同香花油茶无性系炭疽病病菌的致病力还未见报道。本研究以27个香花油茶无性系为材料，采用平行线取样法，对其苗期的炭疽病进行调查与统计，采用形态特征和分子系统学分析法，对各无性系的炭疽病病菌进行鉴定，并采用离体叶片接种法对所获菌株进行致病性及致病力测定，明确各菌株的致病力等级，以期为香花油茶抗病育种及炭疽病防治提供更为科学和可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的27 株感病香花油茶无性系苗木均由广西壮族自治区林业科学研究院油茶所提供，定植于苗圃；炭疽病样品采集于感病叶片。

1.2 炭疽病调查与分级

1.2.1 炭疽病调查

2019—2021年的每年7月，采用平行线取样法调查27个香花油茶无性系的炭疽病发生情况，每个无性系调查30 株；从苗木东、南、西、北和中5 个方向顶端展开的叶片开始，向下随机调查5张叶片，每株记录25 张叶片的发病情况。根据炭疽病分级标准对调查叶片进行分级，计算发病率和病情指数[18]。

1.2.2 炭疽病分级标准

参考彭邵峰等[19]的方法，略作修改，制定香花油茶苗期炭疽病病害分级标准。0级：无病斑；1级：病斑面积占叶面积1/4 以下；2 级：病斑面积占叶面积1/4 ≤～ 1/2；3 级：病斑面积占叶面积1/2 ≤～ 3/4；4级：病斑面积占叶面积3/4以上。

1.3 病菌鉴定

根据苗期叶片炭疽病发病症状，采集典型病害样品进行组织分离，统计不同无性系炭疽病病菌分离频率；依据柯赫氏法则，测定炭疽病病菌致病性；参考相关资料，对致病病菌进行形态特征鉴定，确定致病病菌的种类[20-21]。

进行病菌基因序列测定及多基因序列分析。参考植物基因组试剂盒说明，提取病菌基因组DNA，参考广西普通油茶炭疽病病菌序列测定方法[22]，测定病菌的核糖体转录间隔区（ITS）、肌动蛋白（ACT）、几丁质合成酶（CHS1）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GPDH）基因序列，构建系统发育进化树，确定病菌分类地位。

1.4 菌株致病性及致病力分化测定

1.4.1 接种体准备

将27个无性系炭疽病菌株接种至新的PDA（马铃薯200 g、葡萄糖20.00 g、琼脂粉20.00 g和水1 000 mL）平板培养基上，28 ℃暗培养，产生分生孢子后，挑取分生孢子液，用灭菌水配置成6.00 ×106个孢子/mL的分生孢子液。

1.4.2 致病性测定

采用伤口接种法测定致病性。采集27 个无性系健康成熟叶片带回实验室，清水冲洗干净，用75%酒精进行表面消毒，再用灭菌水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后，将叶片放入铺有滤纸的28 cm×20 cm × 3 cm 透明塑料盒中（叶片背面朝上），叶片基部用脱脂棉蘸无菌水保湿，每个塑料盒中摆放10张叶片。用灭菌接种针在近叶尖处和对角线近叶基处，分别创造1 个3 mm×3 mm 伤口，分别接种菌饼和20 μL 分生孢子液至伤口上，以接种灭菌水为对照；各处理及对照均接种10张叶片。接种后盖上盒盖，置于28 ℃室温生化培养箱中，8 h/16 h 光暗交替培养，10天后计算发病率，并测量病斑大小[18]。

1.4.3 致病力分化测定

采用伤口接种法进行致病力分化测定。采集香花油茶1 号无性系健康成熟叶片，叶片处理和接种方法与1.3.2 相同；27 个炭疽病菌株各接种20 张叶片，对照接种10 张叶片，培养条件与1.3.2 相同。参考杧果（Mangifera indica）炭疽病病情指数分级标准[23]，结合试验，制定香花油茶炭疽病病情指数分级标准。0 级：无病斑；1 级：病斑直径≤3.00 mm；3级：3.00<病斑直径≤9.00 mm；5 级：9.00<病斑直径≤15.00 mm；7级：15.00<病斑直径≤25.00 mm；9级：病斑直径>25.00 mm。菌株致病类型划分标准参考咖啡（Coffea arabica）炭疽病病菌致病力划分标准[24]。强致病力类型的病情指数为40<～100；中致病力类型的病情指数为20<～40；弱致病类型的病情指数为0<～20；无致病类型的病情指数为0。

1.5 数据处理

采用Excel 2010 和DPS 13.01 软件整理和分析数据；采用Duncan's新复极差法进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 炭疽病发病症状

炭疽病主要危害香花油茶的叶片和嫩芽。多从叶尖或叶缘开始感病；感病初期，叶片上出现褐色小圆点，之后逐渐扩大；叶尖感病叶片的病斑由叶尖向叶基呈“V”字形扩展，枯死面积逐渐增加；感病嫩叶上的病斑呈向叶片背面或向上卷曲状态（图1）。嫩芽感病后，呈褐色枯死状，向嫩枝方向逐渐枯死。

图1 部分香花油茶无性系炭疽病危害症状Fig.1 Damage symptoms of anthracnose in some C.osmantha clones

2.2 不同年份炭疽病发生情况

2019 — 2021年，各无性系炭疽病的发病率和病情指数均逐渐升高；平均发病率分别为9.50%、16.02%和18.84%；平均病情指数分别为3.47、6.96和8.97（表1）。2019年，发病率为3.12% ～ 18.04%；其中，21号无性系发病率最低，1号无性系发病率最高。2020年，发病率为9.67%～25.33%；其中，24 号无性系发病率最低，1 号无性系发病率最高。2021年，发病率为12.67% ～ 27.50%；其中，24 号无性系发病率最低，1 和8 号无性系发病率最高。2019年，病情指数为0.90～8.42；其中，21号无性系病情指数最低，4号无性系病情指数最高。2020年，病情指数为4.58 ～ 10.92；其中，14 号无性系病情指数最低，8号无性系病情指数最高。2021年，病情指数为6.21～12.75；其中，24 号无性系病情指数最低，8 号无性系病情指数最高。

表1 不同年份香花油茶无性系炭疽病调查结果Tab.1 Investigation results of anthracnose of C.osmantha clones in different years

续表1 Continued

2019 — 2021年，各无性系炭疽病的发病率增长率和病情指数增长率均呈降低趋势，均表现为2019 — 2020年较高，2020 — 2021年较低（表2）。2019 — 2020年，发病率增长率为14.06% ～73.26%，平均增长率为43.12%；其中，18号无性系增长率最低，21号无性系最高。2020—2021年，发病率增长率为7.89% ～ 25.92%，平均增长率为15.93%；其中，1 号无性系增长率最低，23 号无性系最高。2019—2020年，病情指数增长率为14.77%～82.85%，平均增长率为52.75%；其中，4 号无性系增长率最低，21号无性系最高。2020—2021年，病情指数增长率为11.37% ～ 34.94%，平均增长率为21.23%；其中，2 号无性系增长率最低，14 号无性系最高。

表2 不同年份香花油茶无性系炭疽病发病率及病情指数变化情况Tab.2 Changes of disease incidences and disease indexes of anthracnose of C.osmantha clones in different years(%)

续表2 Continued

2.3 不同无性系炭疽病病菌分离频率

2019 — 2021年，各无性系炭疽病病菌的分离频率均逐渐升高，平均分离频率分别为34.22%、40.74% 和58.81%（表3）。2019年，分离频率为12% ～ 64%；分离频率大于50%的无性系有4 个，分别为1、7、17和22号无性系；分离频率为30%～50%的无性系有10 个，分别为5、6、8、11、12、14、16、20、21 和27 号无性系；其他无性系的分离频率均低于30%。2020年，分离频率为20%～68%；除2和26号无性系与2019年相同外，其他无性系的分离频率均增加；分离频率低于30%的无性系有4 个，分别为2 、9、18 和26 号；分离频率大于50%的无性系有5个，分别为1、7、17、21和22号无性系；其他无性系的分离频率均为30% ～ 50%。2021年，分离频率为28%～92%；除8 号无性系与2020年相同外，其他无性系的分离频率均增加；分离频率低于30%的无性系仅1 个（26 号无性系）；分离频率为30% ～ 50%的无性系有5 个，分别为2、8、9、10 和18 号无性系；其他无性系的分离频率均大于50%。

表3 不同年份香花油茶无性系炭疽病病菌分离频率Tab.3 Isolation frequencies of anthracnose bacteria of C.osmantha clones in different years(%)

2.4 炭疽病病菌鉴定

从27 个无性系获得的炭疽病菌株培养形状相似，代表菌株YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①在PDA 平板培养基上的菌丝呈灰白色至深灰色，先端菌丝色浅，菌落中心色深；气生菌丝茂盛，菌落呈圆形，边缘完整（图2 a～c）。培养后期，菌落中心产生橘红色分生孢子堆，背面产生黑色色素。菌株在PDA培养基上生长较快，25 ℃培养7天，平均菌落直径为82.16 ～ 86.30 mm，平均生长速率为11.74 ～12.33 mm/d。分生孢子单孢，无色，光滑，圆柱状，顶端钝圆或略尖，基部平截，多数具有1 个油球，少数具有2 个油球，大小为（13.99 ～ 16.99）μm ×（4.93 ～5.67）μm（图2 d～f）。分生孢子附着胞呈浅褐色至褐色，圆形或近圆形，边缘完整，少数呈不规则形状，单个或多个，大小为（6.50～10.69）μm×（5.17～9.50）μm（图2 g～h）。菌株形态特征与核果炭疽菌（C.fructicola）一致[12，25]。

图2 部分香花油茶无性系炭疽病病菌形态特征Fig.2 Morphological characteristics of anthracnose bacteria in some C.osmantha clones

通过多基因序列分析，获得代表菌株YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①的ITS、ACT、CHS1 和GPDH序列，在GenBank 上进行BLAST 同源性比对，代表菌株与目标菌株同源性高达99%～100%，下载其他炭疽病病菌序列，用Mega 6.0 的邻接法构建多基因系统发育进化树（图3）。结果显示，YJ1506②、CZ1608 ①和CZ1611 ①菌株与C.fructicola（菌株CSSX7、CMTJ18 和BL30）聚在同一分支上，与其它炭疽病病菌形成独立分支，支持率为99%，结合形态学特征，确定YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①病菌为C.fructicola。

图3 系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree

2.5 致病性测定结果

从27 个无性系感病叶片上共分离出374 株炭疽病病菌，每个无性系分离获得的菌株为7～23株，每个无性系挑选1个代表菌株进行致病性测定。接种3天后，接种点呈褐色至黑褐色，随时间推移病斑逐渐扩展；接种10天后，接种叶片均发病，病斑大小有差异，平均直径为4.00～11.96 mm（表4，图4）。病斑直径最大的为从6号无性系获得的菌株YJ1506②（11.96 mm），与其他菌株差异显著（P< 0.05）；其次为从12 号无性系获得的菌株YJ1614 ①（7.57 mm）；病斑直径最小的为14号无性系获得的菌株YJ1617①（4.00 mm）。对照的接种点变褐色，但未扩展。对感病叶片进行再次分离，获得的菌株与接种菌株形态特征一致；对对照叶片进行再次分离，未获得任何菌株。确定接种的27 个炭疽病菌株均为香花油茶无性系炭疽病致病菌株。

图4 部分香花油茶无性系致病性测定感病症状Fig.4 Susceptible symptoms of some C.osmantha clones in virulence determination

表4 不同香花油茶无性系炭疽病菌株致病性测定结果Tab.4 Determination results of virulence of anthracnose strains from different C.osmantha clones

2.6 炭疽病病菌致病力分化

不同无性系中获得的炭疽病菌株致病力差异显著（P< 0.05）（表5）。从6 号无性系获得的YJ1506②菌株病斑直径最大（12.75 mm），与从其他无性系获得的菌株差异显著（P< 0.05）；其次为从12 号无性系获得的YJ1614①菌株（9.70 mm）；从14号无性系获得的YJ1617①菌株病斑直径最小（3.60 mm）。YJ1506②菌株病情指数最高（51.11），其次为YJ1614①菌株（42.22），病情指数最低的为从4 号无性系获得的YJ1504②菌株（26.66）。依据菌株致病类型划分标准，27 个炭疽病菌株中，YJ1506②和YJ1614 ①菌株为强致病力菌株，占供试菌株的7.41%；其他25个菌株为中等致病菌株，占供试菌株的92.59%；说明香花油茶苗期炭疽病病菌C.fructic⁃ola以中等致病力菌株为优势群体。

表5 不同香花油茶无性系炭疽病病菌致病力分析Tab.5 Analysis on pathogenicity of anthracnose bacteria from different C.osmantha clones

3 讨论与结论

本研究调查2019 — 2021年27 个香花油茶无性系苗期炭疽病发生情况。结果显示，不同无性系发病率、病情指数和炭疽病菌分离频率略有差异，且整体呈上升趋势，可能与香花油茶无性系不同来源、寄主抗病性和病原菌积累有关。

本研究通过病原菌形态特征鉴定，并结合现代分子生物学，分析病原菌核糖体ITS、ACT、CHS1 和GPDH 多基因分子系统发育树，确定从香花油茶无性系苗期获得的炭疽病病菌为C.fructicola，与2016年报道的香花油茶苗期炭疽病病菌相同[12]，但与报道的普通油茶炭疽病病菌胶孢炭疽菌（C.gloeospori⁃oides）[22]、山茶炭疽菌（C.camelliae）不同[26]，可能与寄主不同有关。

从27 个香花油茶无性系中获得的炭疽病菌株培养性状相同或相似，为同一类型炭疽病病菌，菌落浅灰色至深灰色，边缘色浅，菌落中央色深，与杨友联等[25]报道的棉花（Gossypium hirsutum）炭疽病病原之一的C.fructicola及李河等[21]报道的湖南油茶炭疽病病原之一的C.fructicola菌落形态相同；菌落背面产生黑色色素，与李河等[21]报道相同，与杨友联等[25]报道的C.fructicola菌落背面微黄色不同，可能与菌株不同寄主来源有关，与刘文魁[27]报道的不同寄主上的C.fructicola在地理和生物学方面存在较大差异的研究结果相符。

不同香花油茶无性系获得的炭疽病菌株C.fructicola均有致病性，但致病力存在差异，与刘文魁[27]报道的C.fructicola不同菌株致病力存在明显差异的结论相符。本研究结果表明，27 个香花油茶无性系来源的C.fructicola致病力分化明显，其中2 个菌株为强致病力菌株，其他25个菌株为中等致病力菌株，以中等致病力菌株为优势群体，与王薇等[28]报道的苹果（Malus pumila）炭疽叶枯病菌C.fructicola种内存在致病力明显分化现象和彭宇鸿等[29]报道的导致南方梨（Pyrusspp.）早期落叶的的果生炭疽菌C.fructicola致病力有明显分化的结果相似。少数强致病力菌株可作为香花油茶无性系抗病选育、病原物与寄主互作等研究的菌种资源，研究结果对进一步研究该病菌群体间致病力的变化动态及香花油茶抗性无性系筛选和综合防治有重要意义。