何泳愉 沃恩康 杨新燕 杨灿 路鑫怡 项婷婷 马淑敏 郭潮潭

杭州医学院检验医学院与生物工程学院，杭州 310013

据统计，每年的季节性流感会造成29万～65万人死亡，对人类健康构成重大威胁[1-2]。流感病毒基因组中的基因突变会引起抗原漂移，不仅会导致耐药株的出现，还会逃避抗体介导的病毒中和，使得当今的流感疫苗和部分抗病毒药物无法有效地发挥作用[3]。淡豆豉始载于《名医别录》[4]，由黑豆/大豆、桑叶和青蒿等中药发酵而成，常用于治疗感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠等症状[5]。目前关于单味淡豆豉的抗流感病毒研究尚少报道，本文探讨淡豆豉水煎液的体外抗流感病毒作用，现报道如下。

材料与方法

一、材料与试剂

犬肾上皮细胞(MDCK)、A/Puerto Rico/8/1934(H1N1，简称PR8病毒)均为本实验室保存；淡豆豉购自华东医药中药饮品公司(批号190923)；β-actin抗体、HRP结合羊抗鼠抗体IgG均购自杭州华安生物科技有限公司；抗NP抗体、抗M2e抗体、抗M1a抗体均由本实验室制备并保存；神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒、奥司他韦酸、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG、BCA试剂盒、Triton X-100均购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol、逆转录试剂、SYBR Green荧光定量试剂均购自翌圣生物科技有限公司；噻唑兰（MTT）、二甲基亚砜(DMSO)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM/High培养基购自Cellmax；引物序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

二、淡豆豉水煎液的制备与细胞毒性测定

1.淡豆豉水煎液的制备

称取25 g研磨捣碎的淡豆豉颗粒，于冷水中浸泡30 min，加入500 mL纯水煎煮20 min，5 000 r/min的速度离心10 min(离心半径7 cm)去除滤渣，滤液浓缩至125 mL，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，调配生药浓度为200 mg/mL的淡豆豉水煎液，置于-20℃冰箱分装保存备用。

2.细胞毒性实验

用不含血清的DMEM培养液将淡豆豉水煎液和奥司他韦酸分别从200 mg/mL和1 mg/mL按5倍倍比稀释成8个浓度，分别加入长成单层MDCK细胞的96孔培养板中，每孔100 μL，每个浓度6个复孔，同时设立正常细胞组（正常细胞，只加培养液），空白调零组（没有细胞，只加培养液）。上述4组均置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，避光作用4 h后弃去上清，每孔加入150 μL DMSO摇匀10 min，使用多功能酶标仪(BioTek)检测490 nm的吸光度，细胞存活率=(OD药物-OD空白)/(OD正常-OD空白)×100%。

三、淡豆豉水煎液对流感病毒生命周期抑制实验

1.血液凝集抑制实验

用不含血清的DMEM培养液将淡豆豉水煎液从200 mg/mL按2倍倍比稀释为10个浓度(25 μL/孔)，分别与1 HAU和2 HAU的PR8病毒(25 μL/孔)于37℃混合孵育6 h，同时设置病毒对照组(25 μL PR8+25 μL PBS)，空白对照组(50 μL PBS)，每组重复3次，6 h后每孔加入50 μL 1%豚鼠红细胞，置于4℃孵育2～4 h，观察血凝结果。

2.淡豆豉水煎液对流感病毒生物合成抑制试验

设立PR8+淡豆豉水煎液组[淡豆豉水煎液(8 mg/mL，1 mL)+PR8病毒(23HAU，1 mL)]和PR8组[PBS(1 mL)+PR8病毒(23HAU，1 mL)]，各组混匀置于37℃孵育4 h，混合液加入MDCK细胞中感染1 h，弃去混合液，补充无血清DMEM继续培养。分别于 感 染 后 的0、4、8、12、16、20和24 h收 集 细 胞RNA，以实时荧光定量PCR检测病毒基因M1、NP转录水平；于感染后的0、8、16和24 h收集细胞蛋白，以Western印迹法检测病毒基因M1a、NP、M2e的蛋白表达；于感染后24 h固定细胞，以间接免疫荧光检测细胞NP蛋白表达情况。所有试验每组均重复3次。

3.淡豆豉水煎液对流感子代病毒释放抑制试验

将PR8+淡豆豉水煎液组和PR8组混匀置于37℃孵育4 h，混合液加入MDCK细胞中感染1 h后，弃去混合液，补充无血清DMEM继续培养。24 h后收集上清进行血凝实验，根据细胞上清在稀释数倍后是否引起红细胞凝集现象判断子代病毒产生量，每组重复2次。

应用神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测淡豆豉水煎液对神经氨酸酶活性的抑制作用，实验严格按照说明书执行，设置淡豆豉水煎液浓度(125、250、500、1 000和2 000 μg/mL)和奥司他韦酸浓度(25、50、100、200、400和500 μg/mL)，每个浓度重复3次，奥司他韦酸为阳性对照，根据标准曲线计算出药物对神经氨酸酶的抑制百分比。

四、统计学分析

应用Grapad Prime v8.0软件进行绘图和统计学分析，符合正态分布的计量资料采用±s表示，两组之间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、淡豆豉水煎液的细胞毒性结果

如图1所示，选取细胞生存率大于80%的浓度为细胞最大无毒浓度(TC0)，淡豆豉水煎液TC0为8 mg/mL，对照组奥司他韦酸TC0为40 μg/mL。

图1 淡豆豉水煎液(A)和奥司他韦(B)对MDCK的细胞毒性(n=6)

二、淡豆豉水煎液阻碍流感病毒吸附结果

如图2所示，采取两种PR8病毒量(1 HAU、2 HAU)进行实验，正常情况下，病毒对照会使红细胞发生凝集反应，当使用淡豆豉水煎液与流感病毒PR8在37℃共处理6 h后,出现不同程度抑制血凝的作用，血凝抑制活性分别为25 mg/mL(2 HAU)、6.25 mg/mL(1 HAU)，表明淡豆豉水煎液可能存在靶点与血凝素（HA）蛋白的相互作用，从而阻断流感病毒吸附细胞。

图2 淡豆豉水煎液对流感病毒吸附的影响

三、淡豆豉水煎液抑制流感病毒生物合成的结果

在病毒基因转录层面上，与PR8组相比，PR8+淡豆豉水煎液组的流感病毒基因NP、M1的转录水平始终维持在低水平(t=-5.57、-9.71、-34.84、-17.85、-9.90、-8.84、-16.03、-12.33、-20.46、-28.02、-8.71、-38.11、-13.08和-16.17，P均＜0.05，见表2)。在蛋白表达水平层面上(图3 A和表3)，与PR8组相比，PR8+淡豆豉水煎液组在第8～24小时的NP、M1a、M2e蛋白表达明显被抑制(t=-42.53、-65.82、-39.26、-41.63、-94.42、-272.80、-41.63、-47.95和-220.00，P均＜0.05)。免疫荧光结果如图3 B所示，与PR8组相比，PR8+淡豆豉水煎液组衡量NP蛋白表达绿色荧光明显减少(t=-40.59，P＜0.001)，表明淡豆豉水煎液能够抑制NP蛋白的表达，该结果与Western印迹法一致。

图3 淡豆豉水煎液对流感病毒生物合成的影响

表2 不同时间点淡豆豉水煎液对病毒NP和M1基因的转录水平的影响

表3 不同时间点淡豆豉水煎液对病毒NP、M1a和M2e蛋白表达水平的影响

四、淡豆豉水煎液抑制流感子代病毒释放结果

24 h细胞上清中子代病毒的血凝效价显示，PR8+淡豆豉水煎液组的子代病毒血凝效价为PR8组的1/8，表明淡豆豉水煎液可以抑制流感子代病毒的产生（图4）。神经氨酸酶活性抑制实验结果表明，2 000 μg/mL的淡豆豉水煎液即能抑制大于80%的神经氨酸酶活性，且抑制效果呈现剂量依赖关系，IC50=710 μg/mL。使用奥司他韦酸作为阳性对照药物，IC50=67.7 μg/mL（表4）。以上结果提示，淡豆豉水煎液可以通过抑制流感病毒神经氨酸酶活性，阻止新一代子病毒的有效释放。

表4 奥司他韦和淡豆豉水煎液对神经氨酸酶活性的抑制率

图4 淡豆豉水煎液对流感子代病毒血凝效价的影响

讨 论

现代药理研究表明，淡豆豉含有多种生物活性物质包括大豆皂苷、大豆异黄酮、γ-氨基丁酸等[6]，具有降血糖、抗肿瘤、抗骨质疏松、防治心血管疾病等作用[7-9]，而有关抗流感病毒作用的研究仅限于大豆的主要成分(如大豆异黄酮、大豆苷元)调节机体免疫反应[10-11]，或含淡豆豉复方制剂(如银翘散)改善炎症反应和提高奥司他韦抗流感病毒效果方面[12-13]。本研究初步证实了淡豆豉有抑制流感病毒感染的功效，提示淡豆豉也许可以作为抗流感病毒候选药，作进一步研究开发。

一、淡豆豉水煎液可阻碍病毒吸附细胞

HA蛋白抑制剂是一类新型抗病毒药物，可通过作用于流感病毒进入宿主细胞的不同环节，如竞争性结合病毒HA蛋白或细胞唾液酸受体抑制病毒HA吸附宿主细胞，或抑制流感病毒包膜和内体膜的融合过程，从而阻断流感病毒进入宿主细胞[14-15]。从血液凝集抑制试验结果来看，淡豆豉水煎液可以与病毒HA相互作用，竞争性结合宿主细胞表面唾液酸受体，从而阻碍病毒吸附细胞，提示淡豆豉中含有某种化合物单体与唾液酸物类似，今后将尝试使用分子对接技术和生物膜干涉等技术筛选出靶向HA的淡豆豉潜在单体化合物和相互作用的具体结合位点[16]。

二、淡豆豉水煎液可抑制流感病毒的生物合成

流感病毒吸附宿主细胞后脱去衣壳，病毒核糖核蛋白复合体(vRNPs)释放至细胞质随后入核，在核内启动转录和复制过程，新产生的mRNA会核输出至细胞质进行翻译，该过程是流感病毒生长繁殖的重要阶段[17]。本实验监测了淡豆豉水煎液干预后流感病毒感染宿主细胞单个复制周期(24 h)的病毒基因转录和蛋白表达情况，结果显示，PR8组病毒基因NP、M1转录水平在第4～16小时迅速增长，病毒蛋白NP、M1a、M2e在第8～24小时有大量表达，经淡豆豉水煎液干预后，病毒基因转录水平和蛋白表达水平始终维持在低水平且未见高峰的形成，以上结果表明淡豆豉对病毒的基因转录和蛋白表达均有抑制作用，但具体机制还需要进一步探索[18-19]。

三、淡豆豉水煎液抑制神经氨酸酶活性的安全性较好

子代病毒颗粒要经神经氨酸酶切断唾液酸与HA之间的连接才能释放至胞外并感染新的宿主细胞。从24 h细胞上清血凝结果看，淡豆豉能抑制子代病毒的产生，进一步应用神经氨酸酶抑制实验测定淡豆豉抑制神经氨酸酶的能力，发现2 mg/mL的淡豆豉水煎液具有抑制80%神经氨酸酶活性的能力，可以推断淡豆豉可以通过降低神经氨酸酶活性的能力阻断子代病毒的释放。淡豆豉虽然不如奥司他韦酸(奥司他韦体内代谢物)的抑制强度，但安全性相对较好。奥司他韦是一种作用于神经氨酸酶的特异性抑制剂，可以通过抑制子代流感病毒的释放发挥抗流感病毒作用，目前奥司他韦在治疗甲型流感病毒上仍存争议[20-21]。因此，兼备低不良反应和高抑制神经氨酸酶活性的新型抗流感药物有待开发。

四、结语

本研究初步发现淡豆豉水煎液可以通过阻碍病毒吸附，抑制病毒的转录和翻译，以及减少子代病毒释放等过程发挥体外抗流感病毒作用。由于本实验仅为体外细胞研究,且只对流感病毒的生命周期的过程(直接作用)进行探索，存在一定的局限性。今后将尝试通过动物体内实验淡豆豉能否通过调节机体免疫反应作用间接发挥抗流感作用，以更准确地揭示淡豆豉治疗流感病毒的具体机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明何泳愉：实验研究、采集数据、分析数据、统计分析、论文撰写及修改；沃恩康，杨新燕、杨灿、路鑫怡、项婷婷、马淑敏：论文修改；郭潮潭：研究指导、论文指导、经费支持