洪艺勤，唐炳华，于黎爽，李 宁，郭冬青

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是一种冠状动脉疾病，主要是由于冠状动脉粥样硬化血栓的形成，使流向心肌的血液突然完全或部分停止，造成心肌氧失衡，从而导致心肌细胞死亡、心脏重构和继发性心力衰竭[1]。近年来，药理和医疗技术的进步明显降低了心肌梗死的死亡率，但心肌梗死仍然是世界范围内死亡的主要原因。一份关于疾病和伤害发生率的全球报告显示，仅2017年就发生了大约3 790万例由缺血性心脏病引起的心肌梗死[2]。

心肌梗死后，部分心肌细胞死亡，机体自身会通过心肌肥大和形态重塑等方式试图恢复心排血量，但最终仍很可能会引发心力衰竭。当前的治疗手段主要有药物治疗、介入治疗和冠状动脉旁路移植，晚期只能通过心脏移植，但是以上方法存在各种弊端。例如：传统药物治疗不能解决心肌细胞和血管系统的潜在损失，本质上是非治愈性的[3]；直接经皮冠状动脉介入治疗尚未被证明能提高存活率，可能还会增加心肌梗死的短期风险，但并不降低心肌梗死的长期风险[4-5]；心脏移植费用高昂，且心脏供不应求，排斥反应及其并发症仍是心脏移植到目前为止所无法克服的难题。目前，治疗性血管新生被认为是治疗心肌梗死最根本的方法，通过增加缺血心肌的血流灌注，最终达到治疗的目的。血管新生指在现有的血管基础上形成和发展新血管的过程，是心脏损伤后修复的重要过程，是挽救缺血环境、培养新生细胞的重要途径，是缺血性心肌损伤后细胞治疗导致左室功能改善的主要机制[6]，其主要通过激发机体内的细胞促进心肌梗死后梗死区及梗死边缘区生成血管实现，血管新生包括血管生成(angiogenesis)、动脉生成(arteriogenesis)和血管发生(vasculogenesis)[7]。狭义的血管新生指血管生成，包括血管内皮细胞的激活、增殖和迁移及新形成的萌芽的成熟和稳定，是一个涉及多种细胞的复杂多步骤过程[8]。动脉生成是指现有的小动脉互相吻合，建立新的侧支循环，绕过血流中断部位，改善远端缺血组织的血供状态[9]。血管发生指内皮祖细胞所分化形成的血管丛[10]。在胚胎发育时期，内皮祖细胞迁移、分化、结合成簇，形成血岛，血岛的外层细胞是成血管细胞，其可进一步分化成内皮细胞，从而形成最初的血管丛[11-13]，该过程多发生于出生前。但在心肌梗死心肌缺血环境的情况下，心肌自身可触发出生后的血管发生，动员内皮祖细胞渗入损伤部位，分化为成熟的内皮细胞，或通过旁分泌调控现有的内皮细胞，在损伤部位形成新的毛细血管网[14-16]。本研究所述的血管新生是狭义的血管新生。

心肌梗死后心肌自身所能调动的促血管生成能力有限。因此，促进血管新生是如今急性心肌梗死治疗方案中较有前景的一种[17-18]。目前，血管新生治疗心肌梗死主要是通过蛋白/基因治疗、干细胞/祖细胞治疗和外泌体/微泡治疗。其中蛋白/基因治疗的主要限制是外源蛋白在靶组织中的半衰期短，降低了治疗效果，而使用病毒载体作为基因的传递方法也存在免疫攻击的风险；在干细胞/祖细胞治疗中，大多数被注入体内的细胞会在前3 d死于细胞凋亡；纳米级的外泌体/微泡治疗则避开了另外两种方法的局限性(见图1)，成为一个备受期待的研究途径[19]。本研究概述目前外泌体的形成和分离、鉴定手段，从不同细胞来源分析近些年外泌体在心肌梗死后调节血管新生的作用及机制。

图1 血管新生治疗心肌梗死的方法图

1 外泌体

1967年，首次发现血小板释放了一种囊泡样的促凝物质；1983年，Pan和Johnstone在绵羊的血清中又发现了一种胞外囊泡，1987年Johnstone等将其命名为“外泌体”[20]。外泌体最初被认为是细胞排泄废物的“集装箱”，随着对外泌体更加深入的研究和了解，发现外泌体是细胞间沟通的重要方式。

1.1 外泌体的形成 细胞外小泡(extracellular vesicles，EVs)是细胞释放的小脂泡，直径30～200 nm[20]。EVs通常按大小分为外泌体(exosomes)、微泡或微粒子和凋亡小体。外泌体是EVs中的一部分，大小为40～160 nm[21]。细胞质膜先内陷为早期内泌体，内泌体互相融合，形成晚期内泌体，即多囊泡体(MVBs)，MVBs内出芽形成腔内小泡(ILVs)，ILVs与细胞膜逐渐融合，通过Rab家族鸟苷三磷酸酶(GTPases)途径向细胞膜外释放，即通过胞吐被释放到胞外的ILVs被称为外泌体[21]。因此，外泌体的膜结构与细胞膜较接近，具有脂质双分子层结构。有研究发现，当抑制Rab家族GTPases后，大量ILVs便会聚集在细胞内，难以释放形成外泌体[22]。

1.2 外泌体的内容物 外泌体携带的物质包括脂质、代谢物、蛋白质、microRNAs(miRNAs)、mRNAs、长链非编码RNA(LncRNAs)和DNA[21]。外泌体可以直接与邻近细胞相互作用，也可以间接通过体循环与遥远的受体细胞相互作用。外泌体与靶细胞之间的相互作用不仅可以通过细胞表面受体结合，也可以通过内吞作用将其携带的物质释放到受体细胞内[21]。

1.2.1 脂质 是一类广泛存在的化合物，具有细胞膜的结构成分、储能来源和参与信号转导等生物学功能[23]，一系列脂质锚定着外泌体表面装饰的蛋白质。外泌体中的蛋白质主要位于膜上，如跨膜四蛋白(CD81、CD82、CD37和CD63等)在外泌体中富集，其中CD9、CD81、CD63和TSG-101更是最常用的外泌体标记蛋白[20]。mRNAs将DNA所指定的遗传信息传递给核糖体[24]。

1.2.2 LncRNAs 在人类基因组中，大约93%的DNA可以转录成RNA，其中2%是蛋白质编码的mRNAs，其余98%是已知的非编码RNAs。在这些非编码RNAs中，超过200个碱基的RNA被归类为LncRNAs，LncRNAs已被证明在表观遗传控制和转录、翻译、RNA新陈代谢以及干细胞维持和分化、细胞自噬和凋亡以及胚胎发育中发挥重要作用[25]。

1.2.3 DNA 外泌体中包括有单链DNA、双链DNA、基因组DNA、线粒体DNA，甚至反转录的互补DNA[20]。

1.2.4 miRNA miRNA是内源性的单链非编码RNA，含有18～22个核苷酸，通常与靶基因的3′UTR互补序列结合，抑制翻译及促进mRNA降解[26]，外泌体可以通过分泌miRNA，调节下游通路中与血管新生相关基因的表达，从而促进梗死区域的血管新生。

1.3 外泌体的分离和鉴定方法 外泌体的分离主要使用以下两种方法：通过差速离心技术分离，因为较大的囊泡优先在相对较低的离心力下沉淀(10 000×g 离心30 min)，而较小的囊泡，如外泌体则优先在较高的离心力下沉淀(70 000×g～100 000×g 离心90～120 min)[27]；密度梯度离心法，外泌体漂浮在粘性溶液(例如蔗糖或碘化醇)不断稀释的梯度中，离心后迁移到其(平衡)密度区域内[28]，外泌体则多集中1.13～1.20 g/mL密度条带[29]。这两种方法较常用，且经常联合使用。但除此之外，还有尺寸排除色谱，当含有颗粒的溶液通过固定相时，小颗粒能够进入多孔珠，较大的颗粒比小颗粒通过柱的速度更快，并且洗脱的时间点比小颗粒更早，这种方法不仅不会影响外泌体的完整性，还保留了外泌体的功能；超滤是使用具有特定分子量截止值或孔径的半透膜进行分离，简单高效；还可以通过使用特定外泌体表面抗原的抗体进行免疫亲和纯化，这种方法基于一组多达39种不同类型的珠子的使用，每种珠子都与一种捕获抗体相连，并与荧光标记的检测抗体相结合，从而可以分析携带有两种抗体的外泌体[28]。各实验因研究的目的和过程不同，选用的分离方法会略有差别，主要是时间和离心力上的差别，具体情况需根据各自的实验材料和目的进行调节。

针对分离的外泌体目前有多种鉴定方法，主要包括使用透射电子显微镜观察之前所得到的外泌体的直径，一般为40～160 nm；荧光显微镜观察被特异荧光探针标记的外泌体[30]；超分辨率显微镜对于确定外泌体大小甚至亚外泌体分布也有一定的可能性[31]；单粒子干涉反射(SPIR)成像则可以显示50～200 nm的单个外泌体大小，当与常规荧光显微镜相结合时，还可以检测特定脂质、蛋白质、核酸和糖类的存在和丰富[32]；流式细胞术也可为分析外泌体的大小提供有力证据[33]。

2 不同细胞来源外泌体对于心肌梗死后血管新生的作用

外泌体可以从多种类型的细胞中释放出来，不论是生理还是病理条件下，都是细胞间沟通的重要方式。本研究将不同来源且对心肌梗死后血管新生有调节作用的外泌体分为血浆、血清、血小板、巨噬细胞、干细胞、内皮细胞、心肌细胞等11种类型。

2.1 血浆来源的外泌体 Liu等[34]研究发现，血浆中的外泌体可以向骨髓间充质干细胞转移，通过释放miR-144-3p来抑制干细胞中的Ets1表达，从而扰乱基质金属蛋白酶-9(MMP-9)途径，损害骨髓中内皮祖细胞的动员，造成血管生成功能障碍。Chen等[35]在对大鼠进行心肌梗死造模后，对大鼠双后肢进行远端缺血性调节(remote ischemic conditioning，RIC)，发现血浆中的外泌体通过靶向热休克蛋白70(Hsp70)增加了内皮细胞G1期的百分比、细胞迁移、细胞增殖、血管形成，并且抑制细胞凋亡，这一过程不仅促进了内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)和血管内皮生长因子(VEGF)等血管生成相关分子的表达，还改善了心脏细胞重塑，抑制了胶原蛋白沉积，促进血管生成进而降低了梗死率。

2.2 血清来源的外泌体 Geng等[36]认为，从心肌梗死病人血清中提取出来的外泌体miR-143可能来自心肌细胞，其分泌的miR-143可以直接靶向胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)/一氧化氮(NO)途径促进内皮细胞血管新生。

2.3 血小板来源的外泌体 Huber等[37]研究报道，血小板来源外泌体通过分泌miR-320减少内皮细胞中细胞间黏附因子-1(ICAM-1)表达，从而促进内皮细胞运动，防止心肌进一步损伤。

2.4 巨噬细胞分泌的外泌体 Liu等[38]研究心肌梗死显示，促炎症的M1型巨噬细胞释放大量外泌体，具有抗血管生成和加速心肌损伤的作用，其通过分泌miR-155，转移到内皮细胞内，下调Rac家族小G蛋白酪氨酸酶1(Rac1)、p21激活的激酶2(PAK2)、沉默调节蛋白1(Sirt1)和蛋白激酶AMP激活的催化亚基α2(AMPKα2)等靶基因的表达，从而抑制血管生成，导致心功能不全。M1型分泌的外泌体可以通过同时靶向5个分子节点(基因)，抑制Sirt1/AMPKα2-eNOS和Rac家族小GTP酶1-p21(Rac1)激活的激酶1/2(Rac1-PAK1/2)信号通路，抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD31的表达水平，抑制心脏中血管内皮细胞生长因子(VEGFA)-VEGF受体2(VEGFR2)的信号，从而降低内皮细胞的血管生成能力，加重心肌损伤，抑制心脏愈合[38]。抗炎的M2型巨噬细胞可产生促血管生成因子(如白细胞介素-10、血管内皮生长因子和转化生长因子-β)来促进血管生成和组织愈合，但M2巨噬细胞衍生的外泌体的功能有待进一步研究。

2.5 干细胞分泌的外泌体

2.5.1 脂肪干细胞分泌的外泌体 脂肪干细胞释放出外泌体，其中的miR-31被运送到血管内皮细胞后，抑制低氧诱导因子-1(FIH1-1抑制因子)的活性，进而抑制HIF-1α的羟化，防止其被蛋白酶体降解，HIF-1α入核后能调控下游血管新生相关基因的表达从而促进血管新生过程[39]。另外发现，肥胖可以通过降低脂肪干细胞来源的外泌体中miR-126的含量，从而降低其促血管生成潜能[40]。

2.5.2 诱导多能干细胞分泌的外泌体 研究证明，诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)细胞分泌的外泌体能够将生存信号从iPSC传输到邻近的心肌细胞[41]。iPSC分泌的外泌体能够通过自身某些miRNAs和蛋白增强体外培养的小鼠心脏内皮细胞的成管、迁移和抗凋亡特性[42]。

2.5.3 胚胎干细胞分泌的外泌体 胚胎干细胞来源的外泌体可诱导心肌内源性修复，增强心肌细胞存活、分化及扩张，间接通过心脏祖细胞分泌的外泌体，激活内皮细胞，促进血管新生[43]。

2.5.4 间充质干细胞分泌的外泌体 人脂肪来源的间充质干细胞(AD-MSC)的外泌体中的miR-125a可以进入内皮细胞，并通过直接抑制其靶向的δ样蛋白4(DLL4)，来抑制内皮细胞尖端细胞的形成，调节血管生成过程中内皮细胞的萌芽[44]。人脐带来源的间充质干细胞(HUC-MSCs)的外泌体分泌蛋白激酶B(Akt)，通过激活血小板衍生生长因子D促进心脏再生和促进血管生成[45]。人子宫内膜来源的充质干细胞(EN-MSCs)的外泌体分泌的miR-23可以通过靶向Sprouty2和Sema6A，激活促血管生成信号，从而促进心脏内皮细胞的血管生成，EN-MSCs分泌的miR-21可以通过影响靶细胞内磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)/Akt信号通路，促进心肌梗死区域血管新生和心肌细胞存活[46]。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源的外泌体可以通过过表达HIF-1α促进新生血管的形成和抑制心肌梗死大鼠的纤维化来保护心功能[47]，而且，其分泌的miR-210可以通过自身结构性过表达来促进心肌细胞增殖、细胞存活和血管生成来挽救心肌梗死后的心功能[48]。

但目前有研究发现，相较于BM-MSCs和AD-MSCs，EN-MSCs的条件培养基使内皮细胞的凋亡减少，毛细血管形成更多，促血管新生作用优于前两者[16]。

2.6 内皮细胞分泌的外泌体 血管内皮细胞分泌富含miR-214的外泌体，miR-214抑制作为受体的内皮细胞中毛细血管扩张突变(ATM)的表达，从而避免衰老、促进内皮细胞迁移和刺激血管生成[49]。

2.7 周细胞分泌的外泌体 周细胞(pericyte)是一种包围全身毛细血管和静脉中内皮细胞的细胞，可以通过调控内皮细胞增殖分化，进而调控血管生成周细胞既可以分泌大量VEGFA、AngⅠ和适量的VEGF-B186，通过Akt和细胞外信号调节激酶(Erk)诱导血管生成和存活反应，还可以通过自身分泌的外泌体中的miR-132激活Akt，从而激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路，诱导血管新生[50]。周皮细胞还可以通过驱动HIF途径，促进外泌体分泌Manne，从而促进血管生成[51]。

2.8 心肌细胞分泌的外泌体 健康心肌细胞来源的外泌体含有更高含量的促血管生成miR-126，可促进内皮细胞的增殖、迁移和管状细胞的形成，但糖尿病大鼠的心肌细胞含有更高含量的抗血管生成miR-320，抑制血管生成[52]。另外，心肌细胞在低氧情况下释放的外泌体，其中CircHIPK3可以通过抑制miR-29a活性，使VEGFA表达增加，进而促进心肌内皮细胞的细胞周期进程和增殖，促进梗死区周围边缘血管的形成[53]。心肌细胞缺血条件下分泌的外泌体不仅表现出较高水平的基质金属蛋白酶(MMP)，并且还可以促进内皮细胞分泌MMP，而且外泌体含有相对丰富的miR-222和miR-143，其能发挥部分促血管生成效应，协助外泌体改善心肌梗死后新生血管的形成[54]。

2.9 心肌祖细胞分泌的外泌体 心肌祖细胞分泌的外泌体不仅可以通过调控miR322-CUL2-HIF1α信号轴的机制增加内皮细胞的血管生成反应，还可以通过miR-322上调NADPH氧化酶2(Nox2)，增加Nox2衍生的活性氧增加内皮细胞迁移和毛细管形成，从而促进内皮细胞血管生成[55]。

2.10 心肌成纤维细胞分泌的外泌体 成纤维细胞的外泌体可以通过分泌基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和VEGF促进血管新生和抑制心肌细胞凋亡[56]。

2.11 心肌球源性细胞分泌的外泌体 心肌球源性细胞能够使心肌梗死后心脏瘢痕缩小和促进功能性心肌的生长[57]，其分泌外泌体若缺失miR-146a则能够抑制心肌细胞凋亡[58]，含有miR-24则可以减少心肌瘢痕的形成[59]，整个外泌体能够促进心肌细胞增殖，同时促进血管生成[58]。详见表1。

表1 不同细胞来源外泌体对心肌梗死后血管新生的作用

3 小 结

不同细胞来源的外泌体具有促血管新生、抗炎、抑制细胞凋亡、减少细胞自噬、改善心肌梗死后心功能的作用，其低毒性、高稳定性、低免疫原性、高效转运性、与间充质干细胞治疗的等效性，靶向运输性以及纳米级大小、双层脂膜结构、易制取储存等特点，使其成为心肌梗死后心脏修复新的研究热点[16]。外泌体有诸多优势，但因其体积较小，所以提取和定量仍然具有挑战性；而且外泌体能否应用于临床，其自身安全性及并发症是最为需要确定的重要因素。关于外泌体的功能、机制和用途的研究目前仍处于起步阶段。

中医药由于其“多组分、多靶点”的特点，在治疗心肌梗死等复杂性疾病中发挥独特优势。大量活血化瘀类中药已经被证明能够通过促进心肌梗死后血管新生对缺血心肌发挥保护作用，然而针对中药能否通过调控外泌体发挥对缺血心肌的保护作用的研究仍需要进一步探究，可为解决中药药理机制不明的问题提供新的研究思路，对促进中药现代化具有重要意义。研究证明，速效救心丸可以通过作用于小鼠心脏间充质干细胞，通过调节GTPase Rab27途径，从而增加间充质干细胞的外泌体释放，能保护急性的心肌缺血再灌注诱导的细胞凋亡[60]。外泌体载着姜黄素进入体内后，可通过miR-21下调内皮细胞中的白细胞介素-8(IL-8)和细胞黏附因子-1(VCAM-1)，从而抑制内皮细胞黏附，抑制血管新生[61]。补阳还五汤[62]其有效成分可通过增加BM-MSCs来源外泌体中的miR-126，降低miR-221和miR-222，激活VEGF，促进血管生成。低浓度淫羊藿苷能够促进缺氧条件下间充质干细胞分泌的外泌体中miR-126的表达，经旁分泌，通过VEGF信号通路，促进内皮细胞内环境稳定和血管生成[63]。除此以外，研究也证明中药植物也可以分泌外泌体，其中所含有的miRNA能够调控其他物种的基因，被人体吸收后发挥药用植物的药理作用[29]。袁鹏等[64]认为中药制品存在有效成分溶解度不高、生物利用度不高的缺陷，而外泌体作为新兴的细胞间通讯的工具，可能作为中药载体发挥作用。

综上所述，外泌体可能为心肌梗死后心脏修复的一种有效和安全的方法。而中药发挥防治心肌梗死的作用是否通过自身外泌体的产生或者入血后刺激不同细胞分泌外泌体发挥作用仍需进一步探讨。