古丽葛娜·萨吾尔，刘 伟，马学宽，安冬青，4

冠状动脉微循环障碍(CMD)是导致心肌缺血的重要原因[1]。研究发现，CMD发病广泛但尚缺乏有效治疗方案[2]。CMD的发生主要是由于管径<500 μm的冠状动脉微血管结构或功能异常，导致冠状动脉血流量减少，心肌灌注水平降低[3]。冠状动脉微血管内皮细胞(CMECs)作为冠状动脉微血管的主要组成部分，在维持微血管稳态方面具有重要作用[4]。天香丹为名老中医经验方，在治疗冠心病方面具有较好效果。研究显示，天香丹可改善冠心病病人心肌缺血症状，并保护血管内皮[5-6]，但其对CMD的作用机制尚未明确。本研究以CMD大鼠及CMECs损伤模型为研究对象，探讨天香丹对CMD的内皮结构及功能的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞 选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠53只，体质量(200±20)g，随机分为假手术组、模型组、天香丹低剂量组、天香丹中剂量组、天香丹高剂量组及尼可地尔组，每组8只。实验大鼠均购自新疆医科大学动物实验中心，实验环境为无特定病原体(SPF)级。本实验通过伦理委员会批准(编号：IACUC-20170222027)。CMECs购自上海中乔新舟生物科技有限公司(货号：ZQ0882)。

1.1.2 实验药品 天香丹颗粒购自新疆华世丹药业有限公司(批号：新药制字Z20040820，每袋9 g，含生药量3.125 g，其药物成分红景天∶丹参∶新塔花∶降香为8∶8∶6∶3)；尼可地尔购自上海梯希爱公司。月桂酸钠粉剂购自美国Sigma公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 实验试剂 一氧化氮(NO)检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；内皮素-1(ET-1)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自华联生物有限公司；一抗内皮型一氧化氮合酶(eNOS)(ab5589)、一抗CD34(ab81289)、一抗β-actin(ab8227)均购自Abcam公司；二抗HRP标记山羊抗兔(PV6001)购自北京索莱宝公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物建模与给药 大鼠适应性喂养1周后，用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉全身，连接呼吸机辅助通气。在胸骨左侧第3肋、第4肋间打卡胸腔充分暴露心脏和主动脉，使用一次性BD胰岛素针迅速将1 mL/kg的月桂酸钠注入左心室(假手术组注入等量生理盐水)，同时夹闭主动脉约10 s，关闭胸腔，加热垫保持体温，回笼复苏。手术全程无菌操作并由操作熟练的两名专业实验员共同完成。术后连续3 d给予青霉素8×105U腹腔注射预防感染，术后随机选5只模型大鼠，并取出心脏组织，以心肌组织石蜡切片HE染色法观察到微血栓、微血管闭塞视为造模成功。造模完成后，根据体表面积法[7]，假手术组给予生理盐水灌胃，每日2 mL；模型组给予生理盐水灌胃，每日2 mL；天香丹低剂量组给予天香丹灌胃，每日0.81 g/kg；天香丹中剂量组给予天香丹灌胃，每日1.62 g/kg；天香丹高剂量组给予天香丹灌胃，每日3.24 g/kg；尼可地尔组给予尼可地尔灌胃，每日1.35 mg/kg。均连续给药28 d。

1.2.2 心肌微血管超微结构观察 将新鲜心肌组织约1 mm3切片并于2.5%戊二醛固定液中固定24 h后漂洗、固定、脱水、包埋、切片，在透射电镜下观察心肌内CMECs超微结构变化并采集图像。

1.2.3 心肌微血管密度(MVD)测定 用大鼠心肌组织制作石蜡切片，用CD34免疫组化法标记冠状动脉内皮细胞，通过计数棕色内皮细胞或内皮细胞簇的数量进行定量计算MVD，每个组织切片在放大400倍下随机选取5个光学显微镜视野，取平均值作为各样本的MVD。

1.2.4 脂多糖诱导的CMECs损伤模型建立及分组 用内皮细胞专用培养基培养CMECs，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法确定脂多糖诱导的CMECs损伤及天香丹作用于CMECs的最佳浓度及时间。将细胞随机分为4组，对照组：正常CMECs不进行任何干预；脂多糖组：脂多糖10 μg/mL干预24 h；天香丹组：天香丹50 μg/mL干预24 h；脂多糖+天香丹组：脂多糖10 μg/mL和天香丹50 μg/mL同时干预24 h。

1.2.5 NO、ET-1水平检测 每组各取5只大鼠，腹主动脉取血，离心后分离血清，NO、ET-1试剂盒检测血清NO、ET-1水平。收集CMECs各组细胞上清液，用NO检测试剂盒检测细胞上清液NO水平。所有操作均按照试剂盒操作说明进行，用酶标仪测定各孔吸光度，并根据标准曲线计算各组血清NO、ET-1浓度及细胞上清NO水平。

1.2.6 eNOS蛋白表达检测 采用免疫组化法检测心肌切片组织eNOS蛋白表达情况，每张切片随机选取5个视野，以组织出现黄色或棕褐色区域判断有阳性反应，采用Image-Proplus软件进行分析。再从各组大鼠的心肌组织及各组CMECs中提取蛋白进行蛋白免疫印迹法检测，进行电泳、转膜、封闭、洗膜后，加入一抗eNOS(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，相应二抗孵育后，加入ECL显色液，凝胶成像系统曝光后，用Image J软件进行eNOS蛋白定量分析。每项检测重复4次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。定量资料多组间比较采用方差分析，若符合正态分布且方差齐，采用Tukey检验；若不符合正态分布或方差不齐时，采用Kruskal-Wallis检验或Brown-Forsythe检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌微血管结构比较 假手术组大鼠心肌微血管基底膜正常，内皮细胞无肿胀、形态基本正常；模型组大鼠心肌微血管内皮细胞肿胀、胞质增厚，内质网肿胀，细胞核周隙明显增宽，血管腔内存在血栓；天香丹低剂量组大鼠心肌微血管内皮细胞肿胀，内质网肿胀，但血管内无明显血栓形成；天香丹中剂量组大鼠心肌微血管基底膜轻微皱缩，但内皮细胞形态无明显肿胀，管腔内未见血栓；天香丹高剂量组心肌微血管内皮细胞无明显肿胀或皱缩，形态大致正常，管腔内未见血栓；尼可地尔组心肌微血管基底膜可见皱缩，内皮细胞轻微肿胀，血管腔内未见血栓。由此可见，天香丹可能通过减轻微血管内皮水肿、减少微血栓而改善模型大鼠心肌微血管结构。详见图1。

图1 各组大鼠冠状动脉心肌微血管超微结构观察

2.2 各组大鼠心肌MVD比较 与假手术组比较，模型组MVD明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，天香丹中剂量组、天香丹高剂量组及尼可地尔组MVD增加，差异有统计学意义(P<0.05)，其中，天香丹高剂量组MVD增加最明显。说明天香丹可增加CMD大鼠的微血管密度。详见图2、图3。

图2 各组大鼠心肌组织CD34免疫组化染色图

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

2.3 各组大鼠NO、ET-1水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清NO水平降低，ET-1水平升高，NO/ET-1明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示CMD大鼠模型有内皮功能损伤；与模型组比较，天香丹中剂量组、天香丹高剂量组及尼可地尔组NO水平及NO/ET-1明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明中、高剂量天香丹及尼可地尔对CMD大鼠内皮功能具有改善作用，其中天香丹中剂量组内皮功能改善效果更为明显。详见表1。

表1 各组大鼠血清NO、ET-1表达水平()

2.4 各组大鼠心肌eNOS蛋白表达比较 免疫组化结果显示，eNOS主要在血管内皮及其周围表达，且与模型组比较，天香丹中剂量组与尼可地尔组eNOS蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，而与尼可地尔组比较，天香丹低剂量组eNOS水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白免疫印迹法检测显示，与假手术组比较，模型组eNOS蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，天香丹中剂量组、天香丹高剂量组、尼可地尔组eNOS蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。说明天香丹中、高剂量可增加大鼠心肌eNOS的表达，其表达水平与尼可地尔相当，提示中、高剂量天香丹可提高eNOS的表达以改善内皮功能。详见图4～图7。

图4 各组大鼠心肌组织eNOS免疫组化染色图(×200)

与模型组比较，＊ P<0.05，# P<0.01；与尼可地尔组比较，△ P<0.05。

图6 各组大鼠eNOS蛋白表达条带图

模型组与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，△ P<0.01。

2.5 各组CMECs上清液NO及细胞内eNOS蛋白表达水平比较 为进一步证实天香丹对微血管内皮功能保护作用，通过细胞实验检测天香丹干预CMECs后细胞上清NO水平及细胞内eNOS蛋白表达水平。结果显示，与对照组比较，脂多糖组细胞上清液NO水平及细胞内eNOS蛋白表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与脂多糖组比较，脂多糖+天香丹组NO水平、eNOS蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。说明天香丹可促进CMECs细胞内eNOS表达及NO的释放，从而改善内皮功能。详见图8～图10。

脂多糖组与对照组比较，＊ P<0.01；与脂多糖组比较，# P<0.01。

图9 各组CMECs上清液细胞内eNOS蛋白表达条带图

脂多糖组与对照组比较，＊ P<0.01；与脂多糖组比较，# P<0.01。

3 讨 论

CMD是冠心病的重要发病机制[8]。通过正电子发射断层扫描检测1 218例存在心绞痛病人的冠状动脉微血管灌注情况的研究显示，约51%的男性和54%的女性都患有CMD[9]。有研究表明，心绞痛病人存在CMD会使不良心血管事件的风险明显增加[10]。因此，CMD的积极防治对心血管疾病的预防具有重要意义。CMD是由多种因素相互作用而造成的冠状动脉微血管结构或功能异常[11]，其结构异常包括微血管内皮肿胀、破裂或微血管直径或密度改变等[12-13]，功能异常则以内皮功能障碍最为常见[14]，主要表现为血管舒张因子与收缩因子分泌不平衡，导致微血管痉挛、血流量减少、心肌灌注水平降低[15-16]。eNOS是血管壁中NO的主要来源，具有调节微血管舒张功能的作用，保护血管内皮的完整性[17]。研究显示，与大动脉比较，小动脉eNOS蛋白含量明显增加[18]，eNOS水平对维持冠状动脉微血管正常功能具有重要作用。

CMD在中医学中属“胸痹”范畴，心络气血生成不足或气血运行不畅，心失濡养，痰瘀内阻，血脉不通，发为胸痹。本病多为本虚标实之证，故治疗以益气活血为主。如颜德馨教授经验方益心汤以黄芪、党参益气养心为君，辅以葛根、川芍、丹参、赤芍、降香等以活血通脉[19]。吴以岭教授的通心络胶囊以人参为君补益气血，而又以水蛭、赤芍等药物化瘀通络，仍以“益气活血通络”为治疗核心[20]。因此，益气、活血并进，标本兼顾是CMD中医治疗的重要原则。

天香丹由红景天、丹参等中药组成，补心肝之血，肺、脾、肾精元之气，开泄水饮痰浊瘀血。研究表明，天香丹可保护血管内皮功能、抑制炎症反应、减少血栓形成[21-22]。本研究结果显示，天香丹可减轻微血管内皮细胞肿胀，减少微血栓，增加心肌MVD，还可通过增加eNOS的蛋白表达及NO的分泌，改善CMD大鼠的内皮功能。

综上所述，本研究从动物及细胞水平证明了天香丹对心肌微血管结构及内皮功能的保护作用，为天香丹防治CMD提供了客观依据。在后续研究中还需从天香丹改善内皮功能障碍的内在机制角度进行进一步深入探讨。