王晓烨， 冬国友， 刘志英

（1.唐山市妇幼保健院病理科，河北 唐山 063000；2. 唐山市妇幼保健院普外科，河北 唐山 063000）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。转移和复发是导致乳腺癌患者不良预后的主要原因[1]。 寻找乳腺癌的特异性生物标志物，建立有效监控癌细胞侵袭和转移的方法，及时干预，对于延长患者生存时间、改善预后具有重大意义。有研究结果显示，雌激素受体（estrogen receptor，ER）、人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、孕激素受体（progestrone receptor，PR）等细胞因子在乳腺癌中呈异常表达，与乳腺癌的发生、发展及患者预后密切相关[2]。另外，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺细胞的恶性演变中发挥了主要作用[3]。抑制乳腺癌细胞的EMT过程能明显减弱其转移和侵袭能力[4]。上皮型钙黏蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）和E盒结合锌指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）等参与了EMT的调控过程。本研究拟探讨ZEB2和E-Cad在乳腺癌转移、侵袭和预后评估中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2010年7月—2014年7月唐山市妇幼保健院接受乳腺癌根治术的患者80例，年龄32～68岁。收集所有患者术中切除的癌组织及对应的癌旁组织（距癌组织≤3 cm）样本，同时收集其临床病历资料。通过定期电话、门诊复查等形式进行随访，随访时间从手术结束开始至2019年8月或死亡为止。本研究经唐山市妇幼保健院伦理委员会批准。

纳入标准：（1）均经影像学、病理学检查确诊为原发性乳腺癌，病历资料完整；（2）均经手术治疗，术前未经放疗、化疗及其他免疫方法治疗；（3）患者或其家属签署知情同意书。

排除标准：（1）合并其他部位的恶性肿瘤；（2）有腺瘤性息肉病家族史；（3）有严重的肝、肾功能障碍或其他并发症；（4）有其他遗传性乳腺癌综合征；（5）有免疫功能障碍或其他代谢障碍性疾病；（6）有血液系统疾病。

1.2 仪器和试剂

兔抗人ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR单克隆抗体购自美国Abcam公司。免疫组化试剂盒购自南京建成生物有限公司。磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）购自美国Santa Cruz公司，组织裂解液购自美国Millipore公司，Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。BX51T-12P01生物显微镜（日本奥林巴斯公司），T100 PCR仪（美国伯乐公司）。

1.3 ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR蛋白表达检测

将兔抗人ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR单克隆抗体进行1∶500稀释，严格按免疫组化试剂盒说明书进行病理切片及染色，在BX51T-12P01生物显微镜下观察，并记录结果。

1.4 阳性判定标准

免疫组化评分标准[5]：根据染色细胞密度进行评分，阳性细胞比例＜25%为0分，25%～ ＜50%为1分，50%～＜75%为2分，75%～100%为3分；根据组织染色程度进行评分，无色为0分，淡黄色为1分，黄褐色为2分，棕褐色为3分。免疫组化评分为两者评分的乘积。0～3分为蛋白表达阴性，4～9分为蛋白表达阳性。

1.5 癌组织和癌旁组织ZEB2、E-Cad mRNA表达的检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测癌组织和癌旁组织ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA的表达。取适量乳腺组织和癌旁组织样本，研碎、裂解后按Trizol试剂盒要求提取总RNA[6]。将RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA）。采用SYBR Green荧光定量试剂盒和T100 PCR仪检测目的基因的表达。引物由北京力高泰科技有限公司合成。ZEB2 mRNA上游引物为5'-CTCCCAGGTCTGGTGTGTTG-3'，下游引物为5'-GAGGTCTAGGTAGGAGGTGAAG-3'；E-Cad mRNA：上游引物为5'-ACTGTCCGAAT- TGACATCATGG-3'，下游引物为5'-TTCTGAG- CTTCCACCAAAACTC-3'；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物为5'-GGAG- CGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.6 癌组织和癌旁组织ZEB2、E-Cad蛋白表达的检测

采用免疫印迹法检测癌组织和癌旁组织ZEB2、E-Cad蛋白的表达。取癌组织和癌旁组织样本，加入组织裂解液，提取总蛋白，测定蛋白浓度，置于沸水中变性，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉清洗3次后，在封闭液中孵育30 min，加入一抗（ZEB2、E-Cad，1∶500稀释），4 ℃孵育过夜，加入二抗，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，以GAPDH作为内参，采用Image J图像分析软件（美国国立卫生研究院）分析各条带的灰度值。

1.7 乳腺癌分子分型方法

参照相关国际共识[7]中的标准，根据免疫组化结果进行乳腺癌分子分型：ER阳性、PR阳性表达≥20%、HER-2阴性定义为Luminal A型；ER或PR阳性、HER-2阳性定义为Luminal B型；ER和PR阴性、HER-2阳性定义为HER-2过表达型；ER、PR和HER-2均阴性定义为基底样型。

1.8 统计学方法

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，2个组之间比较采用t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关分析评估乳腺癌组织ZEB2与E-Cad的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线分析ZEB2、E-Cad表达与乳腺癌患者生存率之间的关系。采用Cox比例风险模型分析乳腺癌患者5年生存率的影响因素。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析ZEB2和E-Cad判断乳腺癌预后的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织ZEB2、E-Cad阳性表达的比较

免疫组化结果显示，癌组织ZEB2呈阳性表达，E-Cad呈阴性表达；癌旁组织ZEB2呈阴性表达，E-Cad呈强阳性表达。癌组织ZEB2阳性率显著高于癌旁组织（P＜0.001），E-Cad阳性率显著低于癌旁组织（P＜0.001）。见图1、表1。 Spearman相关分析结果显示，乳腺癌组织ZEB2表达与E-Cad表达呈负相关（r=-0.265，P=0.018）。

图1 癌组织和癌旁组织ZEB2、E-Cad蛋白表达的免疫组化结果（×400）

2.2 癌组织与癌旁组织ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA相对表达量的比较

癌组织ZEB2 mRNA相对表达量显著高于癌旁组织（P＜0.05），E-Cad mRNA相对表达量显著低于癌旁组织（P＜0.05）。见图2。

2.3 不同临床病理参数乳腺癌患者之间ZEB2、E-Cad阳性表达的比较

ZEB2表达与肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、HER-2表达均有关（P＜0.05），与年龄、远隔转移、ER表达、PR表达、分子分型、病理类型、组织学分级均无关（P＞0.05）。E-Cad表达与淋巴结转移、TNM分期、ER表达、PR表达、HER-2表达均有关（P＜0.05），与年龄、肿瘤直径、远隔转移、病理类型均无关（P＞0.05）。见表2。

表1 癌组织与癌旁组织ZEB2、E-Cad阳性表达的比较

图2 癌组织与癌旁组织ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA相对表达量的比较

表2 不同临床病理参数的乳腺癌患者之间ZEB2、E-Cad阳性表达的比较

2.4 ZEB2、E-Cad表达与乳腺癌患者总生存率的Kaplan-Meier生存曲线分析

随访结果显示，8 0例乳腺癌患者死亡21例，5年总生存率为73.75%（59/80）。癌组织ZEB2阴性乳腺癌患者的5年总生存率为83.33%，显著高于ZEB2阳性患者（72.06%）（P＜0.05）。癌组织E-Cad阳性乳腺癌患者的5年总生存率为80.00%，高于阴性表达患者（72.86%）（P＜0.05）。见图3、图4。

图3 ZEB2阴性和阳性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

图4 E-Cad阴性和阳性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.5 影响乳腺癌患者预后的因素

以肿瘤直径（＜1.5 cm为0，≥1.5 cm为1）、淋巴结转移（有=1，没有=0）、TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、ZEB2表达（阳性=1，阴性=0）、E-Cad表达（阳性=1，阴性=0）、ER表达（阳性=1，阴性=0）、HER-2表达（阳性=1，阴性=0）、PR表达（阳性=1，阴性=0）作为自变量，以患者的5年生存率为因变量，进行Cox比例风险模型分析。结果显示，淋巴结转移、TNM分期、ZEB2表达、E-Cad表达是影响乳腺癌患者预后的因素[风险比（hazard ratio，HR）分别为3.47、6.49、2.35、0.15，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为2.48～5.67、1.17～8.67、2.00～5.64、0.08～0.78]。见表3。

表3 乳腺癌患者预后影响因素分析

2.6 ZEB2、E-Cad单项检测和联合检测判断乳腺癌患者预后的效能

ROC曲线分析结果显示，ZEB2、E-Cad单项检测和联合检测判断乳腺癌患者5年生存的曲线下面积分别为0.618、0.638、0.827，敏感性分别为73.5%、72.9%、84.5%，特异性分别为77.8%、76.9%、83.7%。见图5。

图5 ZEB2、E-Cad单项和联合检测判断乳腺癌患者5年生存的ROC曲线

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。寻找能反映乳腺癌病变及术后效果的分子标志物，进行个体化诊断和预后预警是目前乳腺癌诊疗领域的研究热点。EMT是肿瘤细胞转移和侵袭的重要过程[8]。有研究结果显示，EMT广泛参与了肿瘤细胞增殖、免疫逃逸和肿瘤血管新生等生物学行为，是肿瘤细胞侵袭和迁移的关键[9]。

穿膜糖蛋白E-Cad主要介导细胞间质之间的特异性连接，是肿瘤细胞EMT中的关键因子，对维持上皮细胞的正常极性、完整性以及抑制细胞逃逸有重要作用[10]。E-Cad表达降低是EMT启动的标志。有研究结果显示，E-Cad蛋白表达异常造成的E-Cad功能障碍与多种肿瘤（鼻咽癌、非小细胞肺癌、宫颈癌等）患者的不良预后和生存率降低密切相关[11]。本研究结果显示，乳腺癌组织E-Cad mRNA及蛋白的表达均低于癌旁组织（P＜0.05）；E-Cad表达与淋巴结转移、TNM分期、ER表达、PR表达、HER-2表达、分子分型、组织学分级有关；Cox比例风险模型分析结果显示，E-Cad表达是乳腺癌患者预后的影响因素。提示E-Cad表达与乳腺癌细胞的转移和侵袭有关。

胞核转录因子ZEB2是E盒结合锌指蛋白家族成员之一。ZEB2介导了肿瘤细胞的EMT过程，可通过调控EMT来实现肿瘤细胞的浸润和转 移[12]。XAVIER等[13]的研究结果显示，ZEB2的高表达可直接提高犬乳腺癌细胞的转移和侵袭能力。ZHOU等[14]的研究结果显示，ZEB2可调控胃癌细胞中转化生长因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）的转录，促进EMT。罗庆丰等[15]的研究结果显示，ZEB2可与鼻咽癌细胞胞核内E-基因的启动子特异性结合，抑制E-Cad蛋白的转录，推动EMT的进程，从而增强鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力。本研究结果显示，乳腺癌组织ZEB2 mRNA及蛋白表达均高于癌旁组织（P＜0.05）；ZEB2表达与肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、HER-2表达有关（P＜0.05）；Cox比例风险模型分析结果显示，ZEB2表达是乳腺癌患者预后的影响因素；Spearman相关分析结果显示，在乳腺癌组织中，ZEB2表达与E-Cad表达呈负相关（r=-0.265，P=0.018）。提示ZEB2可能参与了乳腺癌细胞的转移和侵袭。此外，本研究ROC曲线分析结果显示，ZEB2、E-Cad单项和联合检测判断乳腺癌患者5年生存的曲线下面积分别为0.618、0.638、0.827，敏感性分别为73.5%、72.9%、84.5%，特异性分别为77.8%、76.9%、83.7%。

综上所述，乳腺癌组织ZEB2和E-Cad表达异常，与乳腺癌细胞生物学行为及患者5年生存率密切相关，或可用于评估乳腺癌预后潜在指标。