冯 瑶，樊一鸣，任洪利，许贺然，夏榕嵘，侯振山，李昀婷，马世宇，杨 镇，辛 广,

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161；2.葫芦岛农函大玄宇食用菌野驯繁育有限公司，辽宁 兴城 125100）

黑皮鸡枞菌（）是一种珍贵的药食两用食用菌，其味道鲜美、香气浓郁、营养丰富，有降血糖、抗氧化等作用，与松茸、羊肚、黑虎掌同为我国四大名菌。相关研究主要集中在种质资源、遗传多样性、栽培技术、深层发酵技术以及生物活性评价等方面。黑皮鸡枞菌作为一种中偏高温型菇类，其采后呼吸作用强烈，易腐败变质。为提高其附加值，对黑皮鸡枞菌进行精深加工尤为重要，风味酱是目前最常见的加工产品。

酱类食品起源于中国，具有种类多、营养丰富、味道鲜美、食用方便等优点，广受消费者喜爱。近年来，具有营养和保健功能的食用菌风味酱具有广阔的发展前景。由于黑皮鸡枞菌生产环境复杂，人工栽培技术难度较大，导致其市场销售价格昂贵，以其为原料的加工制品难以走进大众视野。平菇风味独特、营养丰富、价格低廉，在世界范围内被广泛种植和消费。研究发现平菇中游离氨基酸总含量、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和3-辛酮含量高于香菇、双孢蘑菇和金针菇等食用菌，平菇多糖具有抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等多种生物活性。平菇风味酱由于丰富的营养和鲜美的风味已得到人们的广泛关注。因此将其与黑皮鸡枞菌按一定比例复配制作复合型食用菌调味酱，既可降低原料成本，又丰富了黑皮鸡枞菌酱的营养、风味和口感。然而菌酱风味会受不同原料复配比例的影响。

近年来，人们对食用菌酱风味的研究较多，如粟立丹等通过气相色谱-质谱鉴定芳樟醇、4-萜烯醇、苯乙醛、壬醛、-蒎烯、茴香脑等为羊肚菌牛肉酱中主要的挥发性风味物质。Qing Zhenglong等研究发现加入食用菌的牛肉酱，游离氨基酸含量和挥发性成分的种类显著高于纯牛肉酱。风味是食用菌调味酱品质评价的一个重要指标，其中鲜味和香味是食用菌最典型的风味特征：鲜味主要来源于游离氨基酸、5′-核苷酸、肽和有机酸等；香味由挥发性化合物产生。炒制工序是食用菌酱特征风味形成的关键，产品风味除了受原料品种和数量差异的影响之外，也会受炒制时间等因素影响。

对于食用菌调味酱，已有很多关于复合菌酱研制、制作工艺优化及其不同配方产品风味品质的研究，然而炒制过程中产品风味的动态变化是一个新的研究方向。本实验分析不同炒制时间下不同复配比例的黑皮鸡枞菌-平菇复合调味酱的鲜味及香味品质，筛选出最佳炒制时间和两种原料的最佳配比，旨在为改善该复合调味酱的风味品质提供一定理论支撑，也可推动食用菌深加工产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大小、颜色、形状均一、没有机械损伤的黑皮鸡枞菌和平菇均采自辽宁省葫芦岛农函大玄宇食用菌野训繁育有限公司。

盐酸、磺基水杨酸（均为色谱纯） 天津市光复科技发展有限公司；磷酸二氢钾（色谱纯）、5′-鸟苷酸、5′-肌苷酸、5′-黄苷酸、5′-腺苷酸 上海源叶生物科技有限公司；邻二氯苯（色谱纯） 济南荣广化工有限公司；二氯甲烷（色谱纯） 山东闻韶化工有限公司。

1.2 仪器与设备

LGJ-12冷冻干燥机 北京松原华星科技发展有限公司；L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司；SA402B 电子舌 北京盈生恒泰科技有限公司；600型高效液相色谱仪（包含2996 二极管阵列检测器）美国Waters公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（包含氢火焰离子化检测器） 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 不同比例复合酱的制备

将平菇与黑皮鸡枞菌按质量比7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7混合（每份混合食用菌为300 g），清洗干净后切块。在锅中热油，油温控制在160 ℃。分别向锅中加入不同比例混合的食用菌翻炒，加入复合酱质量30%的豆瓣酱和50%的水，再加入5%的白砂糖和50%的水，按上述工艺分别炒制2、3、4、5、6 min。炒制完毕后取样装瓶，经密封灭菌、冷冻干燥后制得粉末样品，备用。

1.3.2 鲜味氨基酸的测定

按照Li Xiaobei等的方法并稍作修改。取1.3.1节中粉末样品各0.3 g，分别加入50 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，超声45 min，10 000 r/min离心15 min。取5 mL上清液，加入等体积的5%磺基水杨酸溶液，混匀后静置15 min，10 000 r/min离心15 min。取上清液，过0.22 μm微孔膜，使用氨基酸自动分析仪进行测定。

1.3.3 5′-核苷酸的测定

参照Feng Yao等的方法并稍作修改。取1.3.1节中粉末样品各0.5 g，分别加入50 mL蒸馏水，煮沸1 min，过0.45 μm微孔滤膜，使用高效液相色谱仪进行测定。

色谱条件：LiChrospher RP-18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：pH 4.2 0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲液；柱温30 ℃；进样量20 µL；波长254 nm。以5′-鸟苷酸、5′-肌苷酸、5′-黄苷酸、5′-腺苷酸为标准品。

1.3.4 等价鲜味浓度（equivalent umami concentration，EUC）的计算

根据游离氨基酸和5′-核苷酸含量计算EUC：

式中：EUC以每克样品中所含味精当量表示；12.18为协同作用常数；a为鲜味氨基酸含量/（mg/g）；a为样品鲜味核苷酸含量/（mg/g）；b为鲜味氨基酸相对呈鲜系数（谷氨酸为1；天冬氨酸为0.077）；b为鲜味核苷酸相对呈鲜系数（5′-肌苷酸为1；5-鸟苷酸为2.3；5′-黄苷酸为0.61；5′-腺苷酸为0.18）。

1.3.5 电子舌味觉值的测定

取1.3.1节中冷冻干燥后的样品各10 g，分别加入30 mL蒸馏水混匀，6 000 r/min离心30 min，取上清液，使用电子舌进行测定。

1.3.6 挥发性成分的测定

1.3.6.1 顶空固相微萃取条件

取5 g 1.3.1节中粉末样品于15 mL顶空瓶中，加入10 μL 1 mg/L邻二氯苯作为内标物，在45 ℃条件下水浴10 min，用50/30 μm CAR/DVB/PDMS萃取头萃取。将在270 ℃老化30 min的萃取头插入顶空瓶中并推出纤维头，在45 ℃下萃取30 min，萃取完成后收回纤维头，立即插入气相色谱进样口，270 ℃解吸5 min。

1.3.6.2 气相色谱-质谱条件

参考李拂晓等的方法稍作修改。

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；载气为氦气，载气流速1.0 mL/min；进样流速1.00 mL/min，不分流进样；进样口温度270 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升温至230 ℃，保持6 min。

质谱条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；进样口温度280 ℃；质量扫描范围/10～450；溶剂延迟时间10 min。

1.3.6.3 挥发性成分的定性和定量

根据挥发性成分总离子流图，使用NIST 11标准谱库进行比对检索（选择匹配度大于85的化合物）并结合人工图谱解析及保留指数资料的查询，确认各个化学成分。保留指数通过C～C正构烷烃计算，采用内标法对挥发性成分进行定量分析。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 炒制时间对黑皮鸡枞菌-平菇复合酱鲜味氨基酸的影响

天冬氨酸和谷氨酸有助于形成蘑菇的典型鲜味。如图1所示，各复配比例下，不同炒制时间的复合酱中鲜味氨基酸含量具有一定差异；天冬氨酸和谷氨酸分别在炒制3 min和4 min含量最高，在炒制3 min和4 min鲜味氨基酸总含量显著高于其他炒制时间（＜0.05）。同一复配比例的复合酱在不同炒制时间下最高的鲜味氨基酸总含量是最低的1.41～1.69 倍。各炒制时间下，平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配时，天冬氨酸含量、谷氨酸含量、鲜味氨基酸总含量均高于其他复配比例。

图1 不同炒制时间、不同复配比例下黑皮鸡枞菌-平菇复合酱的鲜味氨基酸含量Fig.1 Contents of umami amino acids in mixed mushroom sauce with different cooking times and different blending ratios

2.2 炒制时间对黑皮鸡枞菌-平菇复合酱5′-核苷酸的影响

5′-鸟苷酸、5′-肌苷酸和5′-黄苷酸与鲜味成分的协同作用会大大增加蘑菇的鲜味，其中5′-鸟苷酸和5′-肌苷酸是鲜味的主要贡献者。如图2所示，复合酱中5′-鸟苷酸和5′-腺苷酸的含量相对高于5′-肌苷酸和5′-黄苷酸。各复配比例下，5′-鸟苷酸、5′-黄苷酸和5′-腺苷酸的含量整体均随炒制时间的延长而增加；5′-肌苷酸含量随炒制时间的延长先升高后降低，其含量在炒制4 min时最高。5′-肌苷酸含量的下降可能是因为在炒制后期的消耗量大于产生量。不同复配比例复合酱的5′-核苷酸含量具有一定差异；在多数炒制时间下，当平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配时，4 种5′-核苷酸含量高于其他复配比例。

图2 不同炒制时间、不同复配比例下黑皮鸡枞菌-平菇复合酱的5′-核苷酸含量Fig.2 5′-Nucleotide content in mixed mushroom sauce with different cooking times and different blending ratios

2.3 炒制时间对黑皮鸡枞菌-平菇复合酱EUC的影响

EUC是评价5′-核苷酸和鲜味氨基酸协同作用的等效鲜味指标。如图3所示，各复配比例下，复合酱的EUC均随炒制时间的延长先升高后降低，这与上述鲜味氨基酸的变化趋势相似；炒制4 min时，复合酱的EUC均高于其他炒制时间下的EUC。通过Mau等对EUC水平的分级可知：不同复配比例的复合酱在炒制2～6 min时的EUC均属于二级水平（100～1 000 g/100 g）。在各炒制时间下，平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配时，复合酱的EUC高于其他复配比例下的EUC；样品中最高的EUC为最低EUC的1.45～1.62 倍。

图3 不同炒制时间、不同复配比例下黑皮鸡枞菌-平菇复合酱的EUCFig.3 EUC of mixed mushroom sauce with different cooking times and different blending ratios

2.4 炒制时间对黑皮鸡枞菌-平菇复合酱电子舌味觉值的影响

电子舌确定的感官评分与人类感官评估之间存在显著相关性，可以表征蘑菇的味道。如图4所示，各复配比例下，复合酱的鲜味值整体随炒制时间的延长先升高后降低，且明显高于甜味和苦味味觉值。不同复配比例复合酱的鲜味值均在炒制4 min时明显高于其他炒制时间，这与EUC的测定结果一致；甜味味觉值先升高后降低，炒制4 min和5 min时的甜味值明显高于其他炒制时间；苦味味觉值与鲜味和甜味相反，随着炒制时间先降低后升高，在炒制4 min时最低。食用菌的复配比例对风味也有明显影响，各炒制时间下，当比例为4∶6时，该复合酱鲜味和甜味值明显高于其他复配比例。

图4 不同炒制时间、不同复配比例下黑皮鸡枞菌-平菇复合酱的电子舌味觉值Fig.4 Electronic tongue taste values of mixed mushroom sauce with different cooking times and different blending ratios

2.5 炒制时间对黑皮鸡枞菌-平菇复合酱挥发性成分的影响

2.5.1 挥发性成分的定性和定量分析

图5a为不同炒制时间下黑皮鸡枞菌-平菇复合酱挥发性成分聚类热图，共检测出醇类6 种、醛类4 种、酮类5 种、酯类3 种、酸类2 种、含氮化合物3 种、烃类5 种。在炒制2、3、4、5、6 min时分别检测出24、26、28、28、28 种挥发性成分；同一复配比例下，不同炒制时间下挥发性成分的含量也存在显著差异（＜0.05），多数醇类、酮类和吡嗪类物质的含量随着炒制时间的延长先升高后降低，在炒制4 min和5 min时，大多数挥发性成分的含量达到了最高水平。同一炒制时间下不同复配比例复合酱的挥发性成分种类和含量也具有显著差异（＜0.05），当平菇和黑皮鸡枞菌的复配比例为4∶6时，挥发性成分的种类（28 种）、八碳化合物的总含量（15.12～23.33 mg/g）以及含氮化合物的总含量（6.55～8.90 mg/g）均相对较高。

为进一步比较不同炒制时间下复合酱挥发性成分的差异，以同一炒制时间下5 种比例的复合酱为一组，共分成5 组进行聚类分析。由图5b可知，不同炒制时间下的复合酱可总体分为两大类：炒制4 min和5 min下的复合酱挥发性成分相似；炒制2、3 min和6 min时的复合酱挥发性成分相似。

图5 不同炒制时间、不同复配比例的黑皮鸡枞菌-平菇复合酱挥发性成分热图（a）和聚类热图（b）Fig.5 Heat map (a) and cluster heat map (b) of volatile compounds in mixed mushroom sauce with different cooking times and different blending ratios

八碳化合物是食用菌最重要的风味物质，其中醇类通常具有植物香气。1-辛烯-3-醇被鉴定为一种类似蘑菇的风味化合物，具有独特的泥土味和甜味，存在于大多数食用菌中。在炒制初期，1-辛烯-3-醇的含量升高，在炒制4 min时含量最高，之后随着炒制时间的延长，逐渐降低（图5b）。由图5a可知，炒制5 min，平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配的样本中醇类物质的种类（6 种）最多、总含量（11.35 mg/g）最高。

醛类和酮类是脂肪酸降解的主要产物，美拉德反应、氨基酸和碳水化合物的热降解是其重要的产生途径，二者阈值较低，对风味影响较大。由图5a可知，在炒制5 min、复配比例为4∶6的复合酱中醛类物质的种类（4 种）最多、总含量（12.85 mg/g）最高；在炒制4 min、复配比例为5∶5的复合酱中，酮类种类最多（5 种）、总含量（14.69 mg/kg）最高。

吡嗪类物质是脂肪氧化后又参与美拉德反应的产物，具有肉香和烤香味，是加热产品中一种重要的香气物质。由图5可知，2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪分别在炒制5 min和4 min时最高，当炒制时间为4 min、复配比例为4∶6时，二者总含量相对最高，为9.22 mg/g。

前人研究表明，美拉德反应中可能发生氧乙酰化，催化还原糖氧化成相应的酯类，在水性介质中酯类进一步水解为酸。由图5可知，酯类、酸类和一些杂环化合物在炒制后期含量显著高于炒制前期，它们分别在复配比例为4∶6、3∶7和4∶6的复合酱中最高。

这些结果表明：该复合酱在炒制4～5 min且复配比例为4∶6时检测出的挥发性香气物质的种类最多，其含量也相对较高。

2.5.2 黑皮鸡枞菌-平菇复合酱香味品质的综合评价

为筛选香味品质最佳的炒制温度及香气品质最佳的复配比例，分别对5 种复配比例下不同炒制时间的复合酱中挥发性成分进行PCA并计算其综合得分。综合评价得分越高，香味综合品质越好。由表1可知，复配比例为7∶3、5∶5、3∶7的复合酱均是在炒制5 min时具有最高综合得分；复配比例为6∶4和4∶6时，均是在炒制4 min时具有最高综合得分。由表2可知，在5 个炒制时间下，均是平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配时，综合得分最高。这些结果表明：炒制时间为4～5 min、复配比例为4∶6的复合酱香味品质最好。

表1 不同复配比例的黑皮鸡枞菌-平菇复合酱在不同炒制时间下挥发性成分的各PC得分及综合得分Table 1 Principal component scores and comprehensive scores of volatile components of mixed mushroom sauce with each blending ratio at different cooking times

续表1

表2 不同炒制时间下不同复配比例的黑皮鸡枞菌-平菇复合酱挥发性成分的各PC得分及综合得分Table 2 Principal component scores and comprehensive scores of volatile components of mixed mushroom sauce at each cooking time with different blending ratios

2.6 黑皮鸡枞菌-平菇复合酱风味成分的PLS-DA

为比较不同炒制时间下复合酱鲜味和香味成分的差异，对复合酱的非挥发性和挥发性成分进行PLS-DA。

如图6a所示，PC1和PC2的贡献率分别为64.8%和21.6%，二者累计贡献率为86.4%。在PLS-DA模型中观察到不同炒制时间下复合酱的非挥发性化合物和挥发性化合物数据矩阵的明显区分。炒制4、5 min的处理组均在PC1的负侧和PC2的正侧，说明二者差异较小；炒制2、3 min均在PC1的正侧，说明这两组处理也较为相似；炒制6 min的样本均位于PC1和PC2的负侧，与其他4 组相距较远，说明它们之间差异较大。每一聚类中5 个点比较分散，说明同一炒制时间下不同复配比例的样本风味间也具有差异。

图6 不同炒制时间下不同复配比例的黑皮鸡枞菌-平菇复合酱的风味成分的PLS-DA得分图（a）及VIP得分（b）Fig.6 PLS-DA score plot (a) and variable importance in the projection (VIP) scores (b) for flavor components in mixed mushroom sauce with different blending ratios at different cooking times

为筛选出对区分5 组不同炒制时间的样品组具有显著贡献的成分，计算变量重要性投影（variables important in the projection，VIP）值。VIP值＞1.0说明该成分可作为差异标志物。由图6b可知，共识别出14 个VIP值＞1.0的成分，数值从小到大依次为-柠檬烯、苯乙酮、1-辛烯-3-醇、异戊酸、6-甲基-5-庚烯-2-醇、2,5-二甲基吡嗪、金合欢基丙酮、苯并噻唑、甲基庚烯酮、四甲基吡嗪、芳樟醇、苯乙醛、谷氨酸和香叶基丙酮。这些化合物是导致不同炒制时间下，复合酱风味具有显著差异的原因。接下来可从这14 种化合物入手进一步揭示炒制时间对该复合酱风味的影响机制。

3 讨论

本研究结果显示鲜味氨基酸和5′-核苷酸随着炒制时间的延长先升高后降低，炒制4 min时，样本鲜味最佳。烹炒过程中加热时间、加热温度和加热速率均对食品风味特征有重要影响，许多成分会随着加热时间和温度而变化。Yu Min等指出，鲜味氨基酸在热处理下表现出不同程度地下降，是由于氨基酸在美拉德反应中的热降解所引起。加热过程中会同时发生两种反应，即蛋白质或肽水解为氨基酸和作为风味前体的游离氨基酸参与美拉德反应转化为挥发性化合物。炒制2～4 min时，鲜味氨基酸含量显著上升或许是因为高温下鲜味肽或蛋白质发生了热降解，使其产生量高于参与美拉德反应的消耗量；在炒制后期鲜味氨基酸含量降低可能是由于更多的鲜味氨基酸参与了美拉德反应，使其消耗量高于产生量，这也间接促进了更多香味成分的产生。研究表明在烹炒等加热过程中ATP代谢物会形成5′-核糖核苷酸，高温加热过程中核酸链也会降解为核苷酸，这些导致了随炒制时间的延长5′-核苷酸含量的升高。苦味氨基酸等苦味化合物的味道可以被鲜味物质抑制，从而淡化苦味，提高鲜味，这解释了当鲜味值较高时，苦味值较低的原因。炒制过程中随温度的升高和时间的增加，会发生由游离氨基酸与还原糖（如葡萄糖、核糖、甘露糖）之间的美拉德反应和脂类、糖、氨基酸及其反应中间体的热降解与自氧化，从而形成该菌酱特有的香味品质。本研究中香气品质在炒制4～5 min时较好，可能是因为发生了剧烈的上述化学反应；在炒制6 min时，香味品质略有降低，或许是由于长时间的高温加热使一些不稳定的挥发性物质发生了降解。综上，不同炒制时间对黑皮鸡枞菌-平菇复合酱风味成分的影响较大，其主要原因可能在于不同种类化合物的来源与释放速率不同，以及随着时间的变化它们自身发生了氧化或降解。

不同原料的复配比例对产品的口感和风味具有不同影响。成希祥的研究表明当香菇和鸡肉丁的配比为3∶7时，香菇鸡肉酱风味最佳。崔东波以香菇、黑木耳和牛肉为原料，制作了一种保健型复合调味酱，当香菇和木耳比例为2∶1时，产品香气浓郁、口感鲜美。本研究表明相同炒制时间下食用菌的复配比例对产品风味品质的影响也具有一定差异，当平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配时，风味品质最佳，这大大降低了产品的生产成本，使该产品更能走进大众视野。

4 结论

在炒制时间为4 min、平菇和黑皮鸡枞菌以4∶6复配时，复合酱鲜味水平最高；对风味成分的定量和PCA表明，炒制时间4～5 min、复配比例4∶6的菌酱香味品质最佳；PLS-DA表明-柠檬烯、苯乙酮、1-辛烯-3-醇、异戊酸、6-甲基-5-庚烯-2-醇、2,5-二甲基吡嗪、金合欢基丙酮、苯并噻唑、甲基庚烯酮、四甲基吡嗪、芳樟醇、苯乙醛、谷氨酸和香叶基丙酮导致不同炒制时间下菌酱风味的显著差异。然而炒制时间对其风味的影响机制还有待进一步探索。本研究不仅为改善该食用菌复合酱的风味提供了理论基础，也具有一定的实际应用价值。