刘晓辉，郎洪彦，谭成成，张鹏举，王伟霞，朴庆林，李信涛

（吉林省农业科学院动物生物技术研究所，吉林 公主岭 136100）

吉林马是利用引进前苏联重型马（阿尔登、苏重挽、弗拉基米尔等）和轻型马（顿河、苏高血、卡巴金等）与本地马杂交改良，经过28年的联合育种，于1978年成功培育出的挽乘兼用型和重挽型马的新品种［1］。马人工授精技术在中国始于20世纪30年代，具有加速品种改良、提高种马利用效率、减少疾病传播和提高经济效益等优点［2］。马产业发达的国家利用精液低温保存和冷冻保存技术达到高效利用种公马、跨地区进行品种改良的目的［3］。近年来，随着中国马肉、酸马奶等特色产业市场需求增大，马产业得到快速发展［4-6］，但马产业发展过程中存在种公马新鲜精液保存时间短、冷冻精液受胎率低等问题。目前，仍然主要依靠自然交配及鲜精人工输精完成配种工作。精液体外保存时间过短，限制了良种公马种质资源的辐射范围。采用低温保存新鲜精液不仅可以有效避免种公马精液的浪费，提高种公马的使用效率，还可以代替冷冻精液在一定范围内实现跨区域品种改良［7］。

精液的低温保存是将稀释后的精液保存在0˜ 5℃，可保存数天而不丧失受精能力。其原理是利用低温来抑制精子活动，降低精子代谢和运动所需的能量消耗。低温条件下还可以抑制有害物质的生长，延长精子的存活时间。当温度回升后，精子又逐渐恢复正常代谢机能而不丧失受精能力。低温保存的新鲜精液可以提高优良种公马的利用率，加速品种改良进程［8］。

本试验对吉林马精液在低温（4℃）保存下精子运动特性变化开展研究，并对人工授精后母马情期受胎率进行试验，以期为后续更深入提高吉林马种公马科学合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

种公马来自吉林省松原市欣兴牧业马场。选择4匹4˜12岁成年种公马，要求体格健康无疾病，繁殖性能良好为试验用马，按《种公马饲养标准》（DBN654000/T216—2015）要求方法饲养。采精时间为每年4—7月，每匹种公马每周采精2次。选择吉林马母马150匹，母马年龄为4˜10岁，体格健康无繁殖疾病，发情周期正常，每天保证充足的饲草、饮水和光照。

1.2 主要试剂及仪器

果糖、Tris、柠檬酸购自生工生物工程（上海）股份有限公司，青霉素和链霉素为兽用商店购买，卵黄液为实验室自备。

离心机（型号为TDL80-2D），购自上海安亭科技仪器厂；鼓风干燥箱（型号为PH-140A），购自上海一恒科学仪器有限公司；迈朗全自动精子分析仪（型号为ML-210JZ），购自南宁松景天伦生物科技有限公司；一次性输精管（广西蒋氏动物用品有限公司）、一次性子宫角输精管（上海卡苏生物科技有限公司）。

1.3 精液制备

1.3.1 马精液稀释液的配制准确称取Tris 3.028g、柠檬酸1.692 g、果糖1.25 g，加入去离子水充分溶解，煮沸室温冷却后，4℃保存。酒精棉球擦拭蛋壳表面消毒，去除蛋清，刺破卵黄膜，收集卵黄液体。基础液40 mL+卵黄液10 mL+双抗配制成马精液稀释液，置于37℃水浴锅中备用。

1.3.2 精液的采集和处理采精时，用温水清洗种公马阴茎，挑选性情温顺的发情母马作台马或使用假台马。采精人员安装好假阴道，固定好集精杯，通过注水口灌注40℃左右的温水，检查密闭性，采精时保证水温为38˜40℃。待公马爬跨时，采精人员迅速站到台马右后侧，将阴茎导入假阴道内完成采精。采精后，将集精杯缓缓向下倾斜，打开放气阀门，取下集精杯，迅速送至精液处理室，用灭菌纱布过滤精液并统计采精量。原精颜色为不透明乳白色，无异常气味，精子活力达到0.6以上，密度在1.0×109个/mL左右的精液才能使用。

1.3.3 精液的稀释和保存将采集的新鲜精液用稀释液进行1∶1稀释，室温条件下2 000 r/min离心10min弃去上清液，添加38℃的稀释液，轻轻摇匀，分装于15 mL离心管中。留当天用于人工授精的精液，其余精液用脱脂棉或纱布缠裹置于低温（4℃）下保存，每隔12 h轻轻混匀精液1次。

1.4 精子运动参数检测

在24、48、72、96、120 h时将保存的精液于38℃水浴中复苏3 min，然后用全自动精子分析仪检测精子总活力、直线前进活力、平均运动速率。在检测腔室中随机选取3个不同视野，每个视野精子数量不少于300个精子，每次重复检验3次，试验重复5次。

1.5 人工授精

通过直肠检查法检测母马发情状况，每天进行1次发情排卵鉴定。由熟练掌握输精技术人员进行人工输精，所有人工授精试验中使用的精液体积为10 mL。母马每次人工授精使用的精液来自单匹种公马，不得使用混合精液，记录每次输精时间、母马及对应的种公马编号等信息。

1.6 统计分析

试验数据使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，均用“平均值±标准差”（Mean±SD）表示，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 低温（4℃）下不同保存时间对吉林马精子活力的影响

由图1可知，4℃保存的吉林马运动精子活力分别为从0 h的88.7%下降到120 h的40.3%；前向运动精子活力从0 h的78.3%下降到120 h的31.8%；保存24、48和72 h的精子平均路径速度及快速运动精子活力与0 h相比差异不显著（P＞0.05），而保存96 h和120 h的精子平均路径速度及快速运动精子活力与0 h相比差异显著（P＜0.05）。

图1 低温（4℃）保存不同时间吉林马精子运动特性统计结果

2.2 低温（4℃）下不同保存时间对吉林马人工授精情期受胎率的影响

由表1可知，4℃下保存0、24、48、72、96、120 h的吉林马精子，人工授精后母马情期受胎率分别为43.33%、44.00%、44.45%、43.48%、20.00%和10.00%。精子4℃下保存24、48和72 h时母马情期受胎率与0 h差异不显著（P＞0.05），但保存96 h和120 h母马情期受胎率与0、24、48、72 h差异显著（P＜0.05）。

表1 吉林马母马人工授精情期受胎率

3 讨论

随着低温保存时间的增加，精子形态发生改变［9，10］，畸形率会显著增加［11］。温度变化引起的畸形休克可能导致精子膜损伤，活力、DNA完整性、活性氧类产生和顶体的变化，从而降低精子的存活率和受精能力。关于精子低温保存过程中运动能力的下降在牛［12］、羊［13］、猪［14］、驴［15］、鸡［16］等动物的相关研究已有报道。在低温保存前将精液进行稀释可以减少精子受到损伤从而延长精子存活时间。理想的稀释液是保障低温保存效果和人工授精技术顺利实施的关键。精液稀释液含有糖类、缓冲物质、抗冷冻剂等物质，糖类可为精子存活和维持运动能力提供能量，维持精子质膜稳定性。缓冲物质可防止精液pH发生巨变，维持酸碱平衡，稳定精子的生存环境，防止精子因酸性过强而死亡。结果表明，使用柠檬酸-果糖-Tris-甘油-卵黄为稀释液，低温保存24、48和72 h，吉林马精子活力和情期受胎率差异不显著（P＞0.05），该稀释液可以用于马精液的低温保存，在生产中可以推广应用。

人工授精技术是影响马情期受胎率的重要因素。准确掌握母马发情排卵时间，做到适时输精，是提高受胎率的重要环节。此外，输精方式及一次输精输入的有效精子数量也是影响母马受胎率的重要因素。精子和卵子结合完成授精的部位是输卵管的壶腹部，输入子宫的精子需要一定的时间才能到达输卵管壶腹部。研究表明，驴人工授精输入精液体积10˜15 mL，有效精子数量6亿˜8亿个的情期受胎率显著高于2亿个。同时，Oliveria等［17，18］研究了冷冻精液不同输精方式对母驴情期受胎率的影响，子宫体输精方式情期受胎率为0%，而子宫角输精方式情期受胎率为28.26%。杨莉等［19］研究了新鲜精液不同输精方式对母驴情期受胎率的影响，子宫体输精方式情期受胎率为33.33%，而子宫角输精方式情期受胎率为45.16%。付静涛等［20］研究了常规输精和深部输精对马情期受胎率的影响，子宫角深部输精情期受胎率为65.72%，而子宫体常规输精情期受胎率为56.13%。说明子宫角深部输精能显著提高母马情期受胎率，可能是由于精子到达输卵管壶腹部需要消耗大量的能量，子宫角深部输精缩短了精子的运动距离，降低了能量消耗，从而能够提高母马的受胎率。本研究表明精子低温保存时间越长，其平均运动速率下降，人工授精后母马的情期受胎率显著下降。人工授精输精方式及一次输精的有效精子数量对母马的情期受胎率有很大影响，但关于低温保存的精子与不同输精方式及有效精子数量对情期受胎率的影响还需要进一步研究。

4 结论

吉林马精液低温（4℃）保存会降低精子的运动性能，随着时间的延长吉林马精子的活力会逐渐降低，进而导致受胎率的下降。在实际生产中，吉林马精液低温（4℃）保存不超过72 h，人工授精后对母马情期受胎率影响较小，对吉林马乃至整个马业生产具有重大意义。