吉燕华, 江文琳, 高 薇, 孙心瑗, 郭奇峰, 杨清泉, 沈华翔, 曾治君*

(1. 江西中医药大学 实验动物科技中心,江西 南昌 330004; 2. 江西中医药大学 中医基础理论分化发展研究中心 江西省中医病因生物学重点实验室,江西 南昌 330004; 3. 井冈山大学 数理学院,江西 吉安 343009)

烟酰胺又称尼克酰胺,是烟酸和维生素B的酰胺化合物。烟酰胺作为辅酶I和辅酶II的前体,可参与人体各种代谢过程,对维持细胞正常生命活动起着重要作用。临床上,烟酰胺广泛应用于痤疮[1-3]、光敏性皮炎[4-6]等皮肤病的治疗。此外,烟酰胺还参与了黑色素运输,能加速黑色素细胞中黑素小体的运动[7-8]。外用烟酰胺可增加角质层中神经酰胺的含量,增强皮肤的屏障功能,减少水分流失,因而具有良好的护肤效果。烟酰胺具有抗炎[9]、抗氧化[10]和DNA修复[11-12]等药理作用,在心脑血管疾病[13-15]、呼吸系统疾病[16]和免疫系统疾病等方面均具有良好的应用前景。

自18世纪末瑞典科学家发现稀土元素以来,稀土元素已广泛应用于荧光材料[17-20]、电光源材料、永磁材料、储氢材料[21-23]、催化材料[24]、激光材料[25]、超导体材料[26-27]和光纤材料[28-29]。稀土具有较好的发光性能,但同时具有一定的毒性[30-32]。铕作为稀土元素之一,具有较好的发光性能[33-34],同时具有与微量元素相似的性质,而适量的稀土元素可以促进生物体的生理功能[35-36]。此外,稀土元素在发光材料、生物医药等领域也有着潜在的应用价值[37]。

基于上述分析,本文采用溶剂热法合成了铕和烟酰胺的配合物。用红外光谱、元素分析和扫描电镜等对烟酰胺-铕配合物的结构进行表征与荧光特性分析,并进行了体外细胞实验的研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DT5-2B型低速离心机;Quant 250FEG型扫描电子显微镜与透射电子显微镜;ESXTAR6000 TG-DTA型热重分析仪;Nicolet iS5型红外光谱仪;Rigaku/Max-3A型X-射线衍射仪;Vario EL(Elementar Analysensysteme Gmb H)型元素分析仪。

所用试剂均为分析纯,实验用水为二级纯水。

1.2 配合物的合成

将烟酰胺0.3 mmol和硝酸铕0.1 mmol加入25.0 mL内衬聚四氟乙烯反应釜中,然后加入10.0 mL无水乙醇,室温条件下搅拌反应15 min。待反应物与溶剂混匀后密封,于160 ℃的烘箱中反应24 h。自然冷却至室温,反应物依次用水和乙醇洗涤3次,在离心速率为3500 r/min的条件下经离心得粉末状固体,之后于60 ℃条件下干燥24 h后得配合物。

1.3 体外细胞实验

参照本课题组前期实验方案[38],将对数期的肺癌人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)接种于96孔板中,每孔100 μL,细胞浓度为105个/mL。倒置显微镜观测细胞贴壁后,加入不同浓度的药物(0.016、 0.032、 0.063、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000和2.000 mM),设置对照组与调零组,每组设置3个复孔。培养48 h后将上清液吸去,避光条件下加入新配制检测液(90%培养液和10% CCK8试剂),培养2 h后,用酶标仪检测450 nm处波长,根据实验结果计算配合物作用下A549细胞的存活率。

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜分析

将合成的配合物置于玛瑙研钵中研磨,待成粉末后喷金30 s,并置于扫描电镜下观察。图1为配合物的扫描电镜照片。观察图1(a)～(c)可以发现,样品为固定的、大小不均一的微纳米球。图1(a)～(c)为扫描电镜倍数逐渐变大的配合物纳米微球,根据尺寸比例可知,该配合物的微纳米球尺寸介于0.4～2.0 μm之间。

2.2 红外光谱分析

图2为烟酰胺配体和配合物的红外谱图。通过对比可以发现,烟酰胺和铕形成配合物后,在3355～3150 cm-1处酰胺N—H伸缩振动峰消失,表明烟酰胺的酰胺基中的氮氢键在形成配合物时发生断裂。此外,还可以发现烟酰胺在形成配合物后,C=O伸缩振动峰由1680～1630 cm-1迁移至1600～1560 cm-1,推测金属离子铕与烟酰胺中的酰胺基发生配位,使得酰胺键在红外谱图上的吸收峰发生移动。

图1 不同放大倍数下配合物的SEM照片Figrue 1 SEM images of the complex at different magnifications

ν/cm-1图2 烟酰胺配体和配合物的红外谱图Figrue 2 Infrared spectra of nicotinamide and complexe

2.3 元素分析

借助电镜能谱分析,可获得配合物的元素含量分布。配合物的整体元素分布、配合物的区域元素分布和面总谱图分别如图3～5所示。由图3～5可知,配合物中含有碳、 氮、 氧和铕等元素。从图3～4可以看出,铕元素的含量最高,氮元素含量最低,该实验数据与元素分析的结果一致。根据能谱仪检测数据以及元素分析数据测得配合物中碳、 氮、 氧和铕含量的平均值分别为24.46%、 9.73%、 15.78%和50.03%。结合配合物红外谱图和热重分析曲线等,计算得到碳、 氮、 氧和铕的理论含量分别为24.66%、 9.59%、 15.64%和50.11%。

图3 配合物的扫描电镜图(a)，配合物中碳(b)、氮(c)、氧(d)和铕(e)的元素分布Figrue 3 Distribution diagrams of complex integrated elements(a) and elements of carbon(b), nitrogen(c), oxygen(d) and europium(e)

图4 配合物的区域扫描电镜图(a)，配合物中碳(b)、氮(c)、氧(d)和铕(e)的元素分布Figrue 4 SEM image of local complex(a) and Distribution diagrams of elements of carbon(b), nitrogen(c), oxygen(d) and europium(e) in the local complex

图5 配合物的元素分布Figrue 5 Elemental distribution of complex

2.4 热重分析

在氮气氛围下,以10 ℃/min的升温速率,由室温升到800 ℃,对配合物进行热重分析,其结果如图6所示。由图6可知,配合物经历了3个阶段的分解。第一个阶段为25～200 ℃,配合物的质量损失率约为8%,这可能是失去了一分子水。第二阶段为250～420 ℃,质量损失率约为15%,而第三阶段温度范围为420～700 ℃,质量损失率约为19%。可以看出,第二阶段和第三阶段的质量损失率均高于第一阶段,其失重可能是由碳链骨架断裂引起的。随着温度的升高,TG曲线最终趋于平缓,此时剩余物氧化铕的质量分数占总质量的58%。综合以上表征结果可知,烟酰胺与铕的配比为1 ∶1,因而推测出配合物的分子式可能为C6H4N2O·Eu·H2O。

Temperature/℃图6 配合物的TG和DTG曲线Figrue 6 TG and DTG curves of complex

2.5 荧光光谱分析

配合物的荧光发射光谱如图7所示。由图7可知,在394 nm光激发下,配合物的发射峰579 nm归属于5D0→7F0跃迁,591 nm归属于5D0→7F1跃迁,612 nm和618 nm归属于5D0→7F2跃迁,693 nm和699 nm归属于5D0→7F3跃迁。

λ/nm图7 配合物的荧光发射光谱(Ex=394 nm)Figrue 7 Emission fluorescence spectra of complexe(Ex=394 nm)

2.6 细胞实验分析

图8为烟酰胺和烟酰胺-铕配合物的体外细胞实验结果。由图8可知,当配合物的浓度为0.016～2.000 mM时,A549细胞表现出较高的存活率,且存活率均大于90%。烟酰胺配体和配合物对A549细胞的影响趋势基本一致,表明烟酰胺-铕配合物作为医药微纳米材料对细胞以及药物作用的药效影响较小,因而该配合物可作为一种具有较好生物相容性的生物医药微纳米材料。

Concentration/mM图8 不同浓度的烟酰胺配体和配合物作用下的A549细胞存活率Figrue 8 Effects of different concentrations of nicotinamide ligand and complex on A549 cells

本文合成了一种新型烟酰胺-铕配合物,根据表征结果推测配合物的分子式可能为C6H4N2O·Eu·H2O。结果表明:在394 nm激发波长下,配合物的发射峰位于579 nm, 612 nm, 618 nm, 693 nm和699 nm。烟酰胺配体和烟酰胺-铕配合物对A549细胞的影响趋势基本一致,推测该配合物作为医药微纳米材料对该A549细胞影响不大,不存在干扰药物药效的作用。