张丽丽 梁娜娜

(1扬州大学医学院临床医学系，江苏 扬州 225200；2江苏省人民医院浦口分院神经内科)

颈动脉粥样硬化(CAS)是由于巨噬细胞源性泡沫细胞在颈动脉内壁积累形成硬化斑块及病变，导致颈动脉壁增厚，动脉腔狭窄。颈动脉斑块的不断生长或脱落会造成脑供血不足，引发缺血性脑卒中，严重危害中老年人健康〔1〕。CAS受到遗传、饮食和环境等多种因素影响〔2,3〕。脂代谢异常引发的巨噬细胞泡沫化是颈动脉斑块形成的主要因素〔4〕。既往研究发现血液中的氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)可以诱导血管内皮细胞功能失常，引发巨噬细胞内胆固醇积累，并引发巨噬细胞自噬、凋亡，促进巨噬细胞泡沫化〔5,6〕，然而ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化的遗传调控机制还不是很清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的小非编码RNA，其可以通过与靶基因mRNA特定序列互补配对，调控靶基因的稳定性和翻译活性，影响其下游基因的表达〔7〕。当前的研究发现，许多miRNAs深度参与了ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的过程〔8～10〕。本研究通过分析CAS患者与健康志愿者血浆样品中miR-204的表达，进一步利用体外ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化的实验模型，揭示了miR-204在调控巨噬细胞胆固醇积累和凋亡过程中的重要作用。

1 材料和方法

1.1一般资料 (1)CAS组：选择2016年9月至2017年6月在扬州大学医学院附属江都人民医院神经内科经颈动脉超声检查诊断明确的CAS患者35例，男21例，女14例；年龄51～77岁，平均年龄为(67.3±9.1)岁。纳入患者均排除出血或缺血性脑卒中、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及肝、肾、心肺功能障碍。(2)对照组：选择同期医院体检正常者30例，其中男17例，女13例，年龄47～78岁，平均年龄(66.2±9.7)岁。

1.2试剂和耗材 血浆和血清miRNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司)，佛波酯(PMA)、胆固醇含量测定试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反转录试剂混盒(北京全式金公司)，SYBR绿色荧光PCR预混液(美国Roche公司)，RPMI1640培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液、异硫氰酸荧光素(FITC)-膜联蛋白(Annexin)V(美国ThermoFisher公司),人单核细胞白血病细胞(THP-1，武汉普诺赛生命科技有限公司)，人源ox-LDL(上海翊圣生物科技公司)，CCK-8细胞活力检测试剂(日本同仁化学)，饱和油红O染色液(北京索莱宝生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1样本的收集 使用乙二胺四乙酸(EDTA)采血管采集CAS组和对照组空腹静脉血5 ml，血液样品自然沉降2 h后，放置于4℃预冷的离心机中，2 000 r/min离心10 min，收集上层血浆，随后采用QIAGEN公司的血浆和血清miRNA提取试剂盒抽提血浆样品中的总RNA，抽提方法按照产品说明书进行。

1.3.2RNA提取纯化及荧光定量PCR检测 取1 μg总RNA，加入多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸引物，放置于70℃孵育5 min，随后立即放置于冰上退火。在反应体系中加入M-MLV反转录酶、5×反应缓冲液、RNA酶抑制剂，于42℃孵育1 h，得到cDNA。以cDNA为模板，使用SYBR绿色荧光PCR预混液进行实时荧光定量PCR检测miR-204的表达水平。miR-204特异性引物序列正义链：5′-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3′，反义链见试剂盒；选择U6基因为内参，其特异性引物序列为：U6-正义链：5′-GCTTCGAGGCAGGTTACATG-3′；U6-反义链：5′-GCAACACACAACATCTCCCA-3′。

1.3.3细胞培养及转染 THP-1生长于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，放置在37℃、5% CO2培养箱中培养。实验前，在培养基中加入终浓度为100 ng/ml的PMA处理48 h，诱导细胞分化为巨噬细胞，随后转染对照miRNA(NC-miRNA)或miR-204模拟物(mimic)，并用100 μg/ml ox-LDL孵育48 h。THP-1源性巨噬细胞分为4组：NC组，转染NC-miRNA；miR-204组，转染miR-204 mimic；ox-LDL+NC组，转染NC-miRNA，并加入ox-LDL诱导；ox-LDL+miR-204组，转染miR-204 mimics，并加入ox-LDL诱导。

1.3.4细胞内胆固醇含量检测 收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液清洗后，细胞冰上裂解后，3 000 r/min离心去除细胞碎片，并将上清分成3份，分别按照产品说明书测定细胞内总胆固醇、游离胆固醇和蛋白浓度，并计算胆固醇/蛋白相对含量(μg/mg蛋白)，细胞胆固醇脂含量计算公式为：胆固醇脂=总胆固醇-游离胆固醇。

1.3.5油红O染色 取0.1 g油红O粉末溶于10 ml异丙醇中，充分溶解后放置于4℃冰箱保存。染色前，将油红O溶液与蒸馏水按照2∶3比例充分混匀，得到油红O染色液。收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液洗1次，加入4%多聚甲醛溶液室温固定15 min,随后加入500 μl油红O染色液，染色30 min，用磷酸盐缓冲液漂洗3次。

1.3.6CCK-检测细胞活性 各组THP-1源性巨噬细胞等量接种于96孔板中(每孔2×105个)，待细胞充分贴壁后进行转染和ox-LDL处理。48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续放置于37℃培养4 h。使用酶标仪读取450 nm波长的吸光值A，并计算相对细胞活性。

1.3.7流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，经磷酸盐缓冲液漂洗1遍，调整细胞密度至2×106个/ml，取200 μl，1 000 r/min离心，收集沉淀细胞，加入200 μl Annexin V结合缓冲液重悬，再加入10 μl FITC-Annexin V染色液，室温避光孵育15 min，再加入300 μl结合缓冲液，混匀后用流式细胞仪检测，统计FITC阳性细胞比例。

1.4统计学分析 采用统计软件GraphPad7.0进行t检验。

2 结 果

2.1外周血血浆中miR-204的表达 CAS组血浆中miR-204表达水平显著低于对照组(0.72±0.12 vs 1.00±0.09;P<0.05)。

2.2THP-1细胞胆固醇脂积累检测 相比于NC组或miR-204组，ox-LDL+NC组和ox-LDL+miR-204组细胞总胆固醇和胆固醇脂含量均显著上升(P<0.05)，表明ox-LDL处理引起了巨噬细胞内的胆固醇积累。与ox-LDL+NC组相比，ox-LDL+miR-204组细胞总胆固醇含量没有明显变化(P>0.05)，胆固醇脂含量显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞胆固醇脂及点胆固醇比较

细胞胆固醇脂主要贮存在脂滴中。使用油红O对各组细胞染色标记脂滴，从图1可以看出，与NC组和miR-204组相比，ox-LD+NC组和ox-LDL+miR-204组细胞内脂滴的大小明显增大，数量明显变多。然而ox-LDL+miR-204组中脂滴明显小于ox-LDL+NC组。

2.3细胞凋亡水平检测 凋亡细胞FITC-Annexin V染色呈阳性(图2)。与NC组和miR-204组相比，ox-LDL+NC组和ox-LDL-miR-204组细胞凋亡率显著上升(均P<0.05)，而与ox-LDL+NC组相比，ox-LDL+miR-204组细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。见表2。

图2 FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡水平

2.4细胞活力检测 与NC组相比，miR-204组细胞活力没有明显变化(P>0.05)。与NC组和miR-204组比较，ox-LDL+NC组和ox-LDL+miR-204组细胞活力显著下降(均P<0.05)。与ox-LDL+NC组相比，ox-LDL+miR-204组细胞活力显著上升(P<0.05)。见表2。

白色箭头指示细胞内的脂滴图1 各组油红O染色标记细胞内脂滴(×400)

表2 各组细胞活力及凋亡率比较

3 讨 论

CAS会导致颈动脉腔狭窄，引起脑供血不足，甚至诱发缺血性脑卒中，带来严重的健康风险〔1〕。在CAS的疾病进展过程中，由于脂质代谢出现异常，外周血中的单核-巨噬细胞被脂质浸润，并大量摄取血清中的LDL及胆固醇，游离胆固醇进一步在细胞内固化成为胆固醇脂，贮存在脂滴中，引起巨噬细胞泡沫化，成为泡沫细胞〔11〕。泡沫细胞中脂质的积累带来的脂毒性会引发巨噬细胞程序性死亡，并通过分泌大量细胞因子增强局部炎症，也导致血管内皮细胞功能异常，最终形成粥样硬化斑块〔12〕。

血浆中存在大量的外泌体介导细胞间通讯，外泌体中含有的大量miRNA和蛋白参与了许多疾病的进展过程，并可以作为疾病的诊断提供依据〔13〕。研究表明，miRNA作为重要的遗传调控因子，通过调控巨噬细胞、血管内皮细胞的功能，影响了CAS疾病进展〔1〕。Koga等〔14〕发现miR-204在家族性地中海热病人血清中的表达水平明显下降，而细胞水平的实验也表明miR-204可以抑制脂多糖引起的巨噬细胞活化及炎症因子的释放。本研究结果提示miR-204可能参与了CAS疾病的发生过程，过表达miR-204可以抑制ox-LDL引发的巨噬细胞胆固醇脂的积累，而不影响总胆固醇的摄取，在巨噬细胞中过表达miR-204可以抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞活力下降和凋亡，推测其原因可能是由于胆固醇脂积累减少缓解了细胞脂毒性。Yan等〔15〕利用小鼠巨噬细胞RAW264.7研究发现，miR-204可以靶向细胞周期依赖性激酶抑制因子(CDKN)2A,调控巨噬细胞的凋亡，然而miR-204调控巨噬细胞胆固醇脂积累的作用机制还需要进一步研究探讨。

综上所述，miR-204在CAS患者血浆中含量下降，其在调控巨噬细胞泡沫化过程中发挥了重要的调节作用。而含有miR-204的外泌体是否可以缓解CAS的疾病进展还需要动物实验探究。