周叶，邢秀月，李晓丽，王丽娜，陈美君，温林燕

[1.琼海市人民医院 妇科，海南 琼海 571400； 2.海南省人民医院(海南医学院附属海南医院) 妇产科，海南 海口 570311； 3.中南大学湘雅医学院附属海口医院 妇产科，海南 海口 570208]

卵巢癌是全球女性第七大最常见的癌症类型，也是我国女性癌症相关死亡的主要原因之一[1]。在诊断时多数上皮性卵巢癌(EOC)患者已进展至中晚期，腹腔内肿瘤负荷高且广泛，常伴有恶性腹水，导致5年总生存率仅为20%～30%[1- 2]。与其它多种实体癌一样，EOC患者也表现出强烈的免疫反应[3]。最近的研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，例如从血管渗出进入实体瘤微环境的CD8+T细胞，可能是黑色素瘤[4]、结直肠癌[5]、食管癌[6]等肿瘤的阳性预测因子。TILs同样影响EOC患者的预后[7]。调节性叉头状转录因子P3+(Foxp3+)T细胞(Treg)和B7家族与肿瘤免疫逃逸有关，然而目前关于B7家族成员与EOC临床结局的关系尚存有争议[8]，这为免疫检查点抑制剂的临床应用带来了困难。其中B7- H3(即CD276)被证实能够增加活化T细胞γ- 干扰素(IFN- γ)的分泌以及Foxp3产物白细胞介素- 10(IL- 10)、转化生长因子- β(TGF- β)和肿瘤坏死因子- α(TNF- α)的产生[9]。虽然TILs与相关细胞因子之间存在相关性，但对它们之间的相互作用尚未达成共识。因此，为了评估局部和全身的术前免疫反应，我们研究高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者TILs的表现与血清细胞因子水平的关系，以确定血清可溶性CD276(sCD276)是否在HGSOC中起作用，探讨其对HGSOC患者免疫环境的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本项临床研究按照《赫尔辛基宣言》中概述的原则进行。在获得书面知情同意后，从入组人群中采集血样。该研究获得了琼海市人民医院机构审查委员会的批准。对2015年7月至2016年7月期间收集的87例晚期卵巢癌患者的临床资料进行回顾性分析，包括51例晚期HGSOC，16例子宫内膜样亚型，9例黏液性亚型，7例透明细胞亚型，4例低级别浆液性卵巢癌。所有血液样本均在诊断时(治疗前)采集。59例患者在样本采集后进行新辅助化疗和间隔去瘤术，28例患者在首次减瘤术后进行辅助化疗。手术标本在病理科进行组织学评估。所有患者均根据FIGO分期系统进行分期[10]，包括FIGO ⅢC期61例，Ⅳ期(即癌转移期或更高)26例；术后所有患者均接受标准卡铂+紫杉醇方案化疗。无进展生存期(PFS)定义为从卵巢癌诊断到复发或死亡的时间。总生存期被定义为从诊断为卵巢癌到死亡的时间。对于无复发的患者，在死亡时或最后1次随访时对数据进行审查。另外纳入同时期20例年龄与晚期HGSOC患者相匹配的健康志愿者作为健康对照组。

1.2 血清sCD276和其他细胞因子水平检测

采用ELISA法测定所有研究对象血清sCD276、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、IFN- γ、TNF- α及TGF- β水平。

1.3 组织标本获取及免疫组化染色

手术标本用4%福尔马林固定，石蜡包埋，苏木精- 伊红- 藏红花(HES)染色。由两名经验丰富的病理学专家对每个组织学标本的切片进行审查以确认诊断和分级。每例患者选择具有代表性的HES玻片，必须包含肿瘤组织和相邻基质。将福尔马林固定的石蜡包埋块切成5 μm的切片，检测细胞表面CD3、CD4、CD8、CD80(B7- 1)、CD86(B7- 2)、CD276(B7- H3)和FoxP3(Treg标记物)。将玻片去蜡后滴加柠檬酸缓冲液(pH6.0)后，用高压法进行抗原热修复。用ABC试剂盒进行组织化学染色。滴加单克隆抗体后在4 ℃下孵育载片。用0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。所有抗体的反应性均通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的聚共轭二级抗体和二氨基联苯胺显示。切片用苏木精反染，脱水，用盖玻片封片。

1.4 组织样本评估[11]

所有染色组织样本由两名研究人员在不知道患者的临床记录的情况下进行评估。一个样本随机分成4个肿瘤区域，放大倍数为400倍。染色细胞百分率以阳性细胞计数除以阳性细胞与阴性细胞计数之和的平均百分率计算。使用NIS Elements软件(Nikon)分析所有区域，并计数阳性染色细胞。根据染色情况将标本分为低表达组和高表达组两组。CD3、CD4、CD8的临界值设为20%，CD80、CD86、CD276和Foxp3临界值设为10%。CD276以肿瘤细胞膜免疫反应阳性为标志。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 血清sCD276水平与晚期卵巢癌患者预后的关系

与健康对照组相比，晚期卵巢癌患者血清sCD276水平显著升高[(429±73.8) pg·ml-1vs.(234.6±28.1) pg·ml-1，P<0.05]。根据晚期卵巢癌患者血清sCD276水平中位值将患者分为<516 pg·ml-1亚组和≥516 pg·ml-1亚组，绘制Kaplan- Meier生存曲线，对于全部晚期卵巢癌患者，2个亚组患者无病生存期比较，差异无统计学意义(P>0.05，图1A)。然而对于晚期HGSOC患者，≥516 pg·ml-1亚组患者无病生存时间和总生存时间短于<516 pg·ml-1亚组患者(P<0.05，图1B、C)，且无病生存时间<12个月的晚期HGSOC患者血清sCD276水平高于无病生存时间≥12个月的晚期HGSOC患者[337(97.85～739.60) pg·ml-1vs. 236.05(75.23～487.90) pg·ml-1，P=0.009，图1D]。

A.血清sCD276水平与晚期卵巢癌患者的Kaplan- Meier分析；B.血清sCD276水平与晚期HGSOC患者无病生存的Kaplan- Meier分析；C.血清sCD276水平与晚期HGSOC患者总生存的Kaplan- Meier分析；D.晚期HGSOC患者根据无病生存时间(<或≥12个月)分层的血清sCD276水平(a P<0.05)图1 晚期卵巢癌患者血清sCD276水平与预后的关系

2.2 单因素和多因素COX回归分析影响晚期HGSOC预后的指标

单因素分析显示，累及淋巴结、术后残余病灶、Foxp3+≥10%、血清sCD276水平≥516 pg·ml-1与复发和死亡风险相关(P<0.05)。多因素分析显示，术后残余病灶、Foxp3+≥10%、血清sCD276水平≥516 pg·ml-1是晚期HGSOC患者复发和死亡风险增加的独立危险因素(P<0.05)。见表1。

表1 晚期HGSOC患者复发或死亡风险的单因素和多因素COX回归模型分析

2.3 晚期HGSOC患者血清sCD276水平与临床特征的关系

血清sCD276水平≥516 pg·ml-1的晚期HGSOC患者淋巴结受累率更高(P=0.023，表2)。

表2 血清sCD276水平与晚期HGSOC患者临床特征的关系

2.4 晚期HGSOC肿瘤组织膜CD276表达与血清sCD276水平、TILs的关系

通过对肿瘤切片进行免疫组化分析，41例(80.39%)晚期HGSOC患者发现了CD276膜表达阳性。膜CD276+表达与血清sCD276水平升高和Foxp3+表达有关(P<0.05，图2、表3)，与CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+表达无关(P>0.05，表3)。

图2 CD276和Foxp3在晚期HGSOC肿瘤组织中的表达情况 ×200

表3 基于CD276膜表达免疫组化结果分析晚期HGSOC肿瘤组织TILs计数情况

2.5 晚期 HGSOC肿瘤组织CD276表达与血清细胞因子水平的关系

根据免疫组化分析结果，膜CD276+表达与血清TNF- α、IFN- γ水平增加有关(P<0.05，表4)。

表4 晚期HGSOC肿瘤组织CD276膜表达与患者血清细胞因子水平的关系 pg·ml-1

3 讨 论

在本研究中，我们发现肿瘤组织中CD276+表达是晚期HGSOC患者复发或预后不良的独立危险因素。此外，高sCD276水平与肿瘤组织Foxp3+细胞浸润数量增加以及血清TNF- α、IFN- γ水平升高相关。结果表明血清sCD276在HGSOC患者的肿瘤免疫反应中起调节作用，因此可能是肿瘤免疫浸润的无创性标志物。这样的标志物检测可以避免肿瘤活检，在患者复发时组织活检是很困难的。

免疫检查点调节剂，如PD- 1/PD- L1或CTLA4抗体不会募集淋巴细胞，但会破坏免疫抑制，从而恢复细胞毒性T细胞活性。事实上，PD- 1/PD- L1阻断对免疫浸润的肿瘤更有效。PD- 1/PD- L1抗体仅在20%～30%的复发性卵巢癌患者中触发客观肿瘤反应[12]。到目前为止，没有生物标志物与高应答率密切相关，尽管肿瘤细胞和免疫细胞上的PD- L1表达可用于选择对PD- 1/PD- L1治疗更有可能应答的患者[13]。然而，需要病理学样本来评估这些生物标志物。此外，由于癌症的异质性，此类样本可能无法反映疾病。因此在将来可以设想一种个性化方法，在HGSOC患者初始治疗后根据免疫因子的表达拟定个体化治疗方案。sCD276作为肿瘤免疫浸润的替代标志物，可用于选择HGSOC患者进行免疫治疗试验。PD- 1/PD- L1检查点抑制剂对于免疫细胞浸润程度高的卵巢癌患者的临床疗效优于免疫反应低的患者这一结论仍有待证明[14]。到目前为止，卵巢癌免疫治疗试验的结果仍然令人失望。Mesnage等[15]研究表明，新辅助化疗增加了某些HGSOC患者的肿瘤免疫浸润。因此血清sCD276作为肿瘤免疫浸润的标志物可能使我们能够监测新辅助化疗期间的免疫反应，并在新辅助化疗后观察到强烈的肿瘤免疫浸润时选择患者进行免疫治疗。

尽管我们的数据样本量较少，但本研究的一个优势是我们只选择了HGSOC和FIGO Ⅲ～Ⅳ期(即癌病期或肿瘤腹膜扩散)患者，这避免了与其他具有不同分子突变的卵巢癌亚型的混淆(如黏液性、子宫内膜样或透明细胞卵巢癌)。我们观察到HGSOC、黏液癌或子宫内膜样癌患者的生存率与血清sCD276水平之间无相关性，这与其他一些研究[7,16]结论有差异，推测可能是这些研究缺乏免疫细胞标志物和异质性。此外，采用免疫组化实验从这些严格纳入患者的肿瘤组织中鉴定了几种类型的免疫表型标志物，即Foxp3、CD4、CD8以及B7家族分子。结果显示膜CD276+表达与Foxp3+表达有关，而Foxp3+≥10%和血清sCD276水平≥516 pg·ml-1均与晚期HGSOC患者复发和死亡风险相关。

Foxp3属于转录因子叉头盒家族，是Treg分化的主基因，也是在Treg中特异性表达的转录因子。Foxp3存在于肿瘤微环境中，是一种通过干扰T细胞增殖来控制抗肿瘤免疫的负性因子。在肺癌[17]、乳腺癌[18]、肝癌[19]等实体肿瘤中，肿瘤浸润性Foxp3+淋巴细胞表达与预后不良有关。CD276是B7家族的一员，通过其配体传递共刺激或共抑制信号来调节免疫反应，但是其功能及结合配体尚未阐明。肿瘤浸润性CD276阳性淋巴细胞与一些癌症的预后不良相关，包括肺癌[20]、结肠癌[21]、肾癌[11]等。据报道，B7- H3共同刺激CD4+和CD8+T细胞的增殖，增强细胞毒性T细胞的诱导，并在T细胞受体信号转导的存在下选择性地刺激IFN- γ的产生。在本研究中，膜CD276+表达与血清TNF- α、IFN- γ水平升高有关，说明CD276膜表达增加可诱导T细胞向Treg分化，分泌免疫抑制性细胞因子，进而增加T细胞介导的肿瘤逃逸，从而导致患者预后不良。因此，治疗前血清sCD276水平可作为晚期HGSOC患者复发或死亡的潜在危险分层标志物。

总之，晚期HGSOC患者血清sCD276水平升高与肿瘤组织浸润性Foxp3+T细胞数量增加和预后不良有关，且肿瘤组织膜CD276+表达者血清TNF- α、IFN- γ水平普遍升高，血清sCD276水平可作为晚期HGSOC患者危险分层的简单无创生物标志物。