陈柏林，汪贵斌，郭起荣，王佳宏, 2，苏二正, 2，曹福亮*

(1. 南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2南京林业大学轻工与食品学院，食品科学与工程系, 江苏 南京 210037)

银杏(Ginkgobiloba)属银杏纲银杏科银杏属植物，系裸子植物。银杏的种子俗称白果，白果种仁色绿翡翠、口感软糯，在亚洲大部分国家既被当作食品，也可作为药材，具有药食同源的特质。白果种仁中淀粉占种子干质量的60%～70%，其含量与玉米、小麦中的淀粉含量相近[1]，蛋白质含量(质量分数，下同)9%～13%、油脂3%～7%[2]。另外，白果种仁中含有萜内酯、黄酮、有机酸、苯丙素、木脂素糖苷等活性成分[3-4]，使其在抗菌、抗氧化、润肺、止咳、平喘等方面具有突出效果[5]。

白果种仁中含有大量碳水化合物，可以作为酿酒的原料。有学者对白果发酵酒进行了探索，针对酶解和发酵两个层面做了研究[6]。白果没有果汁，无法像水果一样先榨汁再液态发酵，且颗粒较大不能简单复制粮食的固态发酵工艺，因此白果发酵酒的工艺成为酿制过程中的重要环节[7-8]。一些研究者对白果的酶解、糖化和发酵的工艺进行探索和优化，采用果酒酵母为发酵剂，用液态发酵法制作白果酒[9-10]。有研究者采用多种原料配伍发酵的工艺方法，将白果与红景天(Rhodiolarosea)、枸杞(Lyciumchinense)、黄芪(Astragalusmembranaceus)等药材共同发酵，同样采用果酒酵母为发酵剂，用液态发酵法制作白果酒[11-13]。目前市场上的银杏酒多为添加了银杏叶提取物的配制酒，使用白果作为原料酿制酒的产品极少。因此，研究白果酒加工工艺，酿制出能被大众接受的白果酒是银杏资源开发利用的一个重要突破口，不仅丰富了果酒品种，而且能够帮助解决白果产量过剩的问题。与此同时，白果为药食同源的食品，其丰富的营养和保健功效能够提升酒的品质，使人们在饮酒的同时也能起到一定的保健功效。

本研究通过采用不同酶制剂酶解白果淀粉，再使用传统果酒发酵方法发酵。通过单因素试验、响应面试验结合模糊数学感官评价法等方法分析白果酒理化指标，优化白果酒的发酵工艺，以期能为白果或其他淀粉类原料的发酵酒生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料‘大佛指’白果采自邳州市国家银杏良种基地；其他材料有安琪葡萄酒高活性干酵母BV818(安琪酵母股份有限公司)、糖化酶(湖北糖柜食品有限公司)、普鲁兰酶(优宝嘉食品旗舰店)、中温α-淀粉酶(沧州夏盛酶生物技术有限公司)。

仪器包括SpectraMax i3X多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)、S-433D氨基酸自动分析仪(德国SYKAM公司)、LTQ Orbitrap XL液相色谱质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 白果酒发酵工艺流程

鲜果放置一段时间使其外种皮腐烂脱落，去掉外种皮后，使用钝器敲开白果壳，去内种皮后放入4 ℃冰箱中储存待用。取白果仁放入沸水中水浴糊化20 min，沥干后加水打浆。移入锥形瓶中，加入中温α-淀粉酶和普鲁兰酶，盖上封口膜放入水浴摇床中60 ℃水浴震荡酶解1 h。用柠檬酸将酶解液pH调至4.0，加入糖化酶在75 ℃水浴摇床中持续糖化1 h。酶解、糖化完成后立即煮沸3 min作灭活处理。加入白砂糖调糖，加入活化后酵母，用保鲜膜封口，置于28 ℃隔水式恒温培养箱中静置发酵，待发酵结束后用3层纱布过滤，得到的澄清白果酒装入带盖玻璃瓶，封口后80 ℃灭菌10 min，冷却并放入4 ℃冰箱冷藏待用。

主要工艺流程为：新鲜白果→预处理(去皮、剥壳)→清洗→糊化→加水匀浆→酶解糖化→灭酶活→发酵→过滤→灭菌。

1.3 单因素优化试验

1.3.1 酶解试验设计

酶活单位U定义为60 ℃下、1 min内转化1 μg底物的酶量。对购买酶制剂的酶活性进行检测，试验测得普鲁兰酶、糖化酶和α-淀粉酶3种酶制剂的酶活分别为：1 390、14 477、9 047 U/mL，响应面试验中酶制剂添加量用质量分数进行试验。

普鲁兰酶、糖化酶和α-淀粉酶3种酶制剂添加量的单因素试验中，3种酶各设定6个添加梯度(体积分数，下同)，分别为：普鲁兰酶0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%(普鲁兰酶活性分别为1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4 U/mL)；糖化酶0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%(即糖化酶活性分别为72.4、144.8、217.2、289.6、362.0、434.4 U/mL)；α-淀粉酶0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%(α-淀粉酶活性分别为9.1、18.2、27.3、36.4、45.5、54.6 U/mL)。

1.3.2 酶解液中葡萄糖质量浓度和葡萄糖当量测定

选取250 mL三角瓶中加入20 g新鲜白果，糊化匀浆后，分别加入20 g白砂糖和100 mL蒸馏水，按照设定方案加入一种酶制剂，另外两种酶制剂添加量为0.5%，在转速120 r/min、60 ℃条件下，水浴振荡60 min，测量酶解液的葡萄糖质量浓度和葡萄糖当量(DE值)，以研究酶制剂添加量对白果酶解程度的影响。筛选3种酶制剂的合适浓度区间，并确定响应面实验的水平试验范围[14-15]。

1.3.3 发酵条件优化条件及结果测定

发酵时间、加糖量和料液比3个指标的单因素试验中，各项指标分别设定5个水平梯度。发酵时间：5、6、7、8、9 d；加糖比例(质量比，下同)：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5；料液比(g/mL，下同)：1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。

选取250 mL三角瓶中加入20 g新鲜白果，糊化匀浆后，分别加入0.5%的普鲁兰酶、糖化酶和α-淀粉酶，按照设定方案加入蒸馏水和白砂糖后，在转速120 r/min、60 ℃条件下，水浴振荡60 min，再根据不同发酵时间进行单因素实验。发酵结束后测量发酵液的酒精浓度和感官评价得分，以研究发酵时间、加糖量、料液比对白果发酵的影响。筛选3个发酵条件的最优区间，并确定响应面实验的水平试验范围。

1.4 响应面法优化酶解与发酵工艺试验设计

1.4.1 响应面法优化酶解工艺

1.4.2 响应面法优化发酵工艺

根据单因素优化实验结果，以感官评价得分作为响应值，通过Box-Behnken响应面实验中心组合设计的原理，以料液比、加糖比例、发酵时间为响应面优化考察因子，设计3因素3水平试验。各因子水平为料液比1∶4、1∶6、1∶8；加糖比例1∶1、1∶2、1∶3；发酵时间5、7、9 d。对白果的发酵条件进行优化。

1.5 理化指标的测定

酒精度采用密度瓶比重法测定；总酸采用滴定法；还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸显色法[16]；总糖含量采用滴定法[17-18]；发酵液DE值(葡萄糖当量)用还原糖含量与可溶性固形物比值计算[19]；游离氨基酸含量采用全自动氨基酸检测仪分析[20-21]。

1.6 建立模糊数学感官评价

感官评价小组由8名进行过感官评价学习的人员(4名男性，4名女性)组成，于各自独立的工作间进行评价。果酒的品质评价需要综合考虑多方面的因素，包括香气、滋味、色泽、适口性4个指标，各评价指标分为优秀、良好、中等、较差4个等级，对应的评分区间为60～100分[22]。综合感官评定标准如表1所示。

表1 综合感官评定标准

香气、色泽、滋味、适口性4个指标与酒的综合品质相辅相成，为了更合理评价白果酒的综合品质，采用权重统计方法，评价各个指标影响的大小。具体计算方式如下：将各指标进行两两之间的对比，若志愿者认为该指标重要程度更大，则记为1，否则为0，指标自身不进行比较，相同指标比较记1，表示该指标是必要的。所有指标的权重之和等于1。各指标权重评价结果如表2所示。

表2 评价指标权重分布

本试验设定两个评定论域：因素集，即感官质量指标集A= {香气，滋味，色泽，适口性}；评语集，即感官质量评语集B= {优秀(B1)，良好(B2)，中等(B3)，较差(B4)}；由各指标权重得分得出权重域矩阵U=(a1,a2,...,an)，其中a1,a2,...,an[ai∈(0,1)]是各评价指标相应的隶属度，且满足条件a1+a2+ … +an= 1。建立评价系统Y=U×R=(b1,b2,...,bm)过程如下：

不同小写字母表示DE值差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示葡萄糖质量浓度差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference in DE value (P < 0.05), and different capital letters indicate significant difference in glucose content (P<0.05).图1 α-淀粉酶、普鲁兰酶、糖化酶添加量对白果酶解的影响Fig.1 The influence of α-amylase, pullulanase and glucoamylase on enzymatic hydrolysis of Ginkgo biloba seeds

(1)

式中：R表示每个样品的等级评分集合矩阵；r为每一指标对应的等级评分，rij=j(xi) 表示第i个评价隶属于该项目中的j等级，i=1,2,...,n,j=1,2,...,m。每个样品的评判结果向量Y转化为矩阵U和R的乘积。样品的感官综合评分H等于评判结果向量Y乘以各等级对应评分，最终得出样品综合评分结果。

柳枝纤细，迎风摆动，如同少女纤细的腰肢，人们根据柳树的这一特性，将柳枝比喻为少女，出现了“柳腰”、“柳眉”等大量的词汇，文学作品中也常常用柳来指代女性，其实这是人们“取象比类”的思维方法在起作用，符合中华民族的修辞认知。

根据表2中权重得分得到白果酒感官权重因素U=(0.019,0.308,0.365,0.308)。其中香气指标的权重因素最低，滋味最高，说明感官评价小组认为香气指标对白果酒感官评价的贡献较低，而滋味最为重要。综合得分计算公式为：

(2)

1.7 气相色谱质谱(GC-MS)挥发性成分分析

香气萃取方法[23-24]：采用顶空固相微萃取(SPME)。准确称取4.0 g样品于20 mL顶空瓶中。放入60 ℃水浴中平衡10 min，然后插入老化处理的萃取头(250 ℃下老化30 min)顶空吸附萃取30 min，将萃取头插入 GC-MS 进样口，解析10 min。

色谱条件：采用 DB-Wax (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱；载气为高纯He(99.999%)，流速 1.000 mL/min；进样口温度 250 ℃；升温程序为初始温度50 ℃，保持 2 min，再以5 ℃/min的速率升至200 ℃，以10 ℃/min的速率升至220 ℃。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源，电子能量 70 eV，离子源温度250 ℃，接口温度 250 ℃。

1.8 数据处理

利用SPSS 23.0、EXCEL 2016、OriginPro 2016对实验数据进行处理；利用Design-Expert软件设计响应面实验并进行回归和方差分析；利用质谱分析结果通过检索与NIST 05提供的标准质谱进行定性，用面积归一法计算各部分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 酶添加量对白果酶解程度的影响

通过对3种酶制剂添加量进行单因素试验，结果如图1所示。α-淀粉酶添加量为0.1%～0.3%时，酶解后葡萄糖含量显著上升，α-淀粉酶添加量为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%时葡萄糖含量均无显著性差异(P<0.05)，说明α-淀粉酶最适添加量为0.3%。葡萄糖当量(DE值)在α-淀粉酶添加量为0.1%～0.2%时显著上升，在0.2%时有最大值41.91%。之后随添加量增加DE值持续下降，添加量在0.1%、0.4%、0.5%时DE值无显著差异(P>0.05)。普鲁兰酶添加量在0.1%～0.2%时，葡萄糖含量和DE值都存在显著上升，而0.2%至0.4%区间均呈下降趋势。糖化酶添加量在1.0%时,葡萄糖含量和DE值均达到最大，分别为42.21 g/L和69.87%，糖化酶在1.0%～1.5%时葡萄糖含量出现小幅度下降，之后持续上升，而DE值在添加量达到1.0%之后，呈下降趋势。综合考虑，选择α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶的最适添加量分别为0.2%、0.2%、1.0%，即2、2、10 g/L。

根据单因素试验结果，DE值的标准差比葡萄糖含量更大，说明DE值的变化程度更大。根据响应面设计规则选用DE值(Y1)为响应值，利用Design-Expert 8.06软件进行Box-Behnken响应面优化分析，得到DE值(Y1)与α-淀粉酶(A1)、普鲁兰酶(B1)、糖化酶(C1)3个因素间的回归方程：

Y1=78.32+0.52A1-0.25B1-5.11C1-0.11A1B1-0.38A1C1+0.62B1C1-3.62A12-4.24B12-5.15C12，R2=0.944 4。

对响应面结果进行方差分析，结果见表3。

由表3可知针对DE值选用二次项模型进行回归拟合，得到的模型P值为0.001 3，说明自变量与响应值的线性关系显著，可以用该模型进行后续的优化分析；失拟项P值为0.23即线性关系不显著，说明二次项模型在整个回归区域内拟合较好，模型拟合成功。

表3 回归模型的方差分析

结合图2交互作用对响应值的影响结果可看出，A1B1和A1C1交互作用更好，说明了α-淀粉酶添加量对酶解液的DE值影响更大。

图2 白果酶解过程各因素交互作用的响应面图Fig.2 The response surface graph of the interactive effects of enzymolysis process of Ginkgo biloba seeds

2.2 白果酒发酵工艺优化

对白果发酵阶段的发酵时间、加糖量、料液比进行单因素试验，研究结果如图3所示。料液比(g/mL)在1∶2～1∶6时，发酵酒的酒精度上升显著(P<0.05)，在料液比(g/mL)为1∶6时酒精度和感官评价得分都达到最高，分别为16.17%和87.52。发酵第6天到第7天酒精度上升显著(P<0.05)，在第8天达到最高值15.67%，发酵时间7、8 d的酒体酒精度差异不显著(P>0.05)，表明发酵时期接近尾声。感官评价方面，发酵时间第5～6天期间感官得分上升显著(P<0.05)，之后的7～9 d差异不显著(P>0.05)，说明该发酵阶段口感风味基本稳定。从图3可以看出加糖量比(g/g)在1∶1～1∶2的时候酒精度和感官得分上升显著(P<0.05)，但它们在1∶2～1∶5 时均存在显著下降趋势(P<0.05)，推测是因为增大蔗糖浓度对酵母产生了抑制作用，造成酒精含量降低。同时过高的加糖量也对口感风味有较大影响。

不同小写字母表示感官评价得分值差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示酒精度差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference in sensory evaluation score (P<0.05), and different capital letters indicate significant difference in alcohol content (P<0.05).图3 发酵时间、加糖量、料液比对白果酒发酵的影响Fig.3 The effects of solid-liquid ratio, fermentation time and sugar addition on the fermentation of Ginkgo biloba wine

综合单因素试验结果考虑，选择最适条件料液比(g/mL)1∶6、发酵时间7 d、加糖量比例1∶2进行响应面实验设计。利用Design-Expert 8.06软件进行数据分析，方差分析结果见表4。感官得分(Y2)的响应面曲线模型P值为0.000 1，说明自变量与响应值的线性关系显著，而酒精度(Y3)的模型P值为0.061 1(不显著)。因此选取感官评价得分进行响应面分析。优化后响应值的动态参数方程为：

Y2= 88.21 + 0.60A2+ 4.23B2-0.39C2+ 1.20A2B2-0.01A2C2+ 0.39B2C2-3.31A22-3.57B22-1.56C22，R2= 0.973 6；

式中：Y2为感官评价得分，A2为料液比，B2为加糖比例，C2为发酵时间。

进一步对响应面结果进行分析，结果见表4。

表4 回归模型的方差分析

图4 发酵条件各因素交互作用的响应面图Fig.4 The response surface methodology for the interaction of fermentation conditions

2.3 最优白果酒发酵工艺验证与理化指标分析

经过对白果酶解和发酵两个阶段加工工艺的优化，得到最佳酶解工艺参数为：α-淀粉酶添加量0.21%，普鲁兰酶添加量0.19%，糖化酶添加量0.70%;换算成酶活性分别为19.1、2.7 和101.4 U/mL。预测DE值最高为79.6%。最佳发酵工艺参数为：料液比(g/mL)1∶6.4，加糖比例为1∶2.6，发酵时间7.91 d。考虑到实验操作可行性，选取料液比为(g/mL)1∶6.4，加糖比例为1∶2.6，发酵时间为8 d。通过验证实验，测得酶解液DE值均值为78.1%，预测值为79.6%，说明该酶解优化模型可用于预测白果酶解后DE值与酶添加量的关系。发酵后进行酒体理化指标检测和感官评价分析，感官评价得分为87.35，与预测值89.54的误差为2.45%，说明该发酵优化模型可用于预测白果发酵酒的口感与料液比、加糖量、发酵时间的关系。

发酵后产品理化指标检测结果表明：白果发酵酒的还原糖14.9 g/L、总糖16.21 g/L、挥发酸0.076 g/L、总酸3.24 g/L、酒精度12.7%、干浸出物12.92 g/L、游离氨基酸含量2.18 g/L。根据农业部制定的绿色果酒标准NY/T 1508—2017，该工艺制备的白果酒为半甜型。总酸稍低于标准，原因可能为白果自身酸度较低，并且酒精发酵温度低，导致发酵产酸少[25-26]。其他指标均符合绿色果酒标准。发酵酒整体口感酸甜，颜色呈浅黄色，澄清透明。

3 结 论

通过单因素试验和响应面试验确定了白果酒发酵工艺。白果酶解阶段α-淀粉酶的添加量对酶解液DE值的影响最大，发酵阶段料液比对发酵后口感影响最大，加糖量次之。优化工艺为：酶解阶段α-淀粉酶添加量19.1 U/mL，普鲁兰酶添加量2.7 U/mL，糖化酶添加量101.4 U/mL；发酵阶段料液比(g/mL)为1∶6.4，加糖比例为1∶2.6，发酵时间为8 d。采用优化后工艺进行加工，得到一种浅黄色澄清透明且营养价值丰富、口感清香的半甜型白果酒，为制备白果发酵酒提供一定理论依据。