王 骞，包慧芳，丁荣荣，史应武，杨红梅，楚 敏，王 宁*

（1.新疆维吾尔自治区土壤肥料工作站，乌鲁木齐 830006；2.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091；3.新疆生产建设兵团第七师农业科学研究所，新疆 奎屯 833200）

引言

生物防治是在现代农业生产中形成的一种科学治理方式，微生物源生物农药是防治作物病虫草害行之有效的方法之一。枯草芽孢杆菌（Bacillus subiltis）具有繁殖快、所需营养简单，耐受性强等优点，同时，其易于形成芽孢的特点在生产过程中利于生防菌剂的制备、剂型加工及保存[1]。因此，作为生物农药的重要资源，受到越来越多的关注与开发。随着分子测序技术的发展，明确菌株基因组序列信息对揭示其生防潜力具有重要意义。枯草芽孢杆菌可通过营养竞争、分泌抗菌物质、诱导抗性等机制发挥生防作用，但能否在作物根际有效定殖是其发挥作用的首要条件，通常生防菌群体定殖数量高低与其防效好坏呈正相关[2]。研究发现，生防细菌在植物根际土壤中主要以生物膜的形态附着在土壤粒子表面或植物根系表面。生物膜的形成可增强微生物对外界环境的耐受性，使细菌群体数量以群聚的形式维持在较高水平，利于有效占据保护植物根系的侵染位点，达到保障营养竞争和空间竞争的群体数量，同时还和其它生防机制协同作用，降低病虫草害的发生，最终达到促进植物健康生长的目的[3]。所以，生防细菌生物膜形成的研究将为生防菌株的遗传改良及其合理使用提供科学依据和遗传信息。瓜列当又称分枝列当（Orobanche acgyptiaca Pers.），是列当科一年生全寄生性植物，对新疆甜瓜、番茄、辣椒等经济作物危害严重。本研究前期对一株源自新疆番茄田的枯草芽孢杆菌DNKAS进行抗瓜列当的防效验证，小区实验表明菌剂添加量为3.2 kg/亩时，防治效果可达52.33%，番茄增产56.48%[4]。本研究主要从基因组信息角度揭示DNKAS菌株的生防机理。本实验利用全基因组测序技术对菌株DNKAS基因组进行功能注释与比较基因组分析，获得该菌株基因组基本特征。重点比对分析该菌株群体感应与生物膜形成相关基因的组成和差异，为深入研究其定殖特性，揭示其防控瓜列当草害的防效作用机制积累了基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌DNKAS（B.subtilis DNKAS），由新疆农业科学院微生物应用研究所保藏，分离自新疆加工番茄农田。

1.1.2 培养基

菌种保存、活化及扩增培养基均为营养肉汤（NB）和营养琼脂培养基（NA），购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 试剂与试剂盒

细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen）、DL2000（Takara）、琼脂糖（Takara）、50×TAE buffer（Takara）和GelGreen核酸染料（Biotium），用于DNKAS菌株基因组DNA提取和检测。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取与检测

菌株活化后无菌接种于NB培养基中，在37℃、180 r/min条件下培养16 h，将发酵液8 000 g离心10 min收集菌体，使用基因组提取试剂盒提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA样品的浓度和降解程度，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测样品纯净度。

1.2.2 基因组测序与基因功能注释

将检测合格的基因组DNA委托青岛华大基因研究院运用BGISEQ-50平台测序，SOAPdenovo组装软件对reads数据进行组装，得到的scaffold序列使用BLAST软件与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO（Gene Ontology）、NR（Non-Redundant Protein Database）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、SwissProt（UniProtKB/Swiss-Prot）、NOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)等6个数据库进行序列比对分析，完成基因功能注释[5]。

1.2.3 同源基因组学分析

基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)完成全基因组序列比对，找出与DNKAS序列相似度99%以上的菌株信息。将DNKAS菌株基因组序列与相关参考菌进行比较分析，统计其同源基因基本特征。运用OrthoMCL软件，选择perl脚本分析特有和共有基因，单拷贝直系同源基因运用single-copy orthologs进行鉴定。系统进化树利用TreeBeST软件构建[6]，设置自展1 000次的置信值，5%的序列差异。

1.2.4菌株生物膜形成相关基因分析

根据全基因组进化分析结果，选取与DNKAS菌株亲缘关系最近的8株B.subtilis与相对较远的1株B.thuringiensis。使用Diamond(v0.8.23.85)软件[7]与KEGG(v87)[8]数据库比对，确定生物被膜相关的基因，并根据基因信息确定其位置信息。通过blast比对查看生物被膜基因序列同源性，与选取的参考菌株的相应蛋白序列基因进行比对和同源性分析。

2 结果与分析

2.1 基因组数据组装与基因预测

测序得到的DNKAS菌株原始reads数据进行质控、质量评估和组装后共得到24个基因组重叠群(contig)，基因组总长度为4 248 244 bp，组成19个基因组框架(scaffold)，GC含量为43.42%。DNKAS基因组序列已经提交到GenBank数据库，获得全基因组注册号JABUOT000000000。DNKAS菌株基因组总长度为4 248 244 bp，预估可编码4 359个基因，占全基因组的88.88%，编码基因平均长度是866.19 bp，获得序列中包括69个tRNA，4个rRNA和49个sRNA基因。含有串联重复序列（TR序列）68个，其中微卫星DNA（Microsatellite DNA）1个，小卫星DNA（MinisatelliteDNA）47个。

2.2 枯草芽孢杆菌DNKAS功能注释

采用本地BLASTP的方法对DNKAS进行COG功能注释，在DNKAS基因组中共有3 796个基因被成功注释。通过聚类分析，发现其蛋白质功能主要集中在8个方面，包括：一般性功能预测基因（389个)、氨基酸代谢及转运基因（328个）、碳水化合物转运和代谢基因（327个）、转录基因（327个）、细胞壁/膜/包膜生物发生基因（242个）、翻译、核糖体结构和生物合成基因（231个）、信号转导机制基因（212个）、辅酶的运输和代谢基因（199个）、无机离子的转运和代谢基因（197个），各基因的功能注释占COG数据库功能注释总基因数的百分比依次为10.2%、8.6%、8.6%、8.6%、6.4%、6.1%、5.6%、5.2%、5.2%、5.1%、4.6%。功能未知基因有239个，占比6.3%。氨基酸代谢及转运、碳水化合物转运和代谢占比较高，这可能说明该菌株可广泛利用环境中营养，即环境适应性强，该特征是优良生防菌具备的特征之一。

在KEGG数据库中，枯草芽孢杆菌DNKAS共有2 775个基因得到功能注释，可以分成30个亚分类图，关于菌株膜运输和碳水化合物代谢功能的基因得到较多的注释。利用注释的功能基因构建代谢通路图，最终获得159个代谢通路。GO数据库中发现共有5 793个基因得到功能注释，主要注释为生物过程、细胞成分和分子功能3部分，具体的注释基因数量结果见图1。NR即非冗余的蛋白质数据库，经过比对，在NR数据库中DNKAS基因组有3 924个基因得到注释。Swiss-Prot数据库主要对蛋白质序列进行注释，拥有较高的可靠性，DNKAS基因组中有3 924个基因的蛋白序列在该数据库中得到功能注释。

图1 枯草芽孢杆菌DNKAS基因组GO功能分类

2.3 同源基因组分析

经NCBI比对，与DNKAS全基因组序列同源性97%以上菌株有289株，高度相似即同源性99%以上菌株有8株，选取这8株菌与DNKAS进行同源性比较，ATCC10792为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），为B.subtilis同属不同种的菌株，是本研究选取的基因组外群，基本情况见表1。维恩图（图2）表明包括DNKAS在内的9株枯草芽孢杆菌共有2 400个同源基因，其中同源基因家族数量为1 354个。依据这10个菌株全基因组同源基因分析数据，进行直系同源单拷贝基因多序列比对，基于TreeBeST软件构建进化树（图3），结果显示9株B.subtilis与B.thuringiensis形成明显分枝，DNKAS与NCD-2、UD1022遗传距离更近，与ZD01、BSD-2、HJ5、BAB-1、SX01705、XF-1遗传距离相对较远。

表1 基因组基本情况

图2 DNKAS菌株与其它芽孢杆菌的同源性比较

图3 进化树分析

2.4 基因功能注释生物被膜相关基因比较

利用Diamond(v0.8.23.85)软件将DNKAS菌株的蛋白序列在KEGG(v87)数据库中进行比对，找到与生物被膜相关的基因，随后根据基因信息找到重叠群的信息，DNKAS菌株生物膜形成相关基因的具体定位信息见表2，共有26个生物膜形成基因，行使20种功能，分布于7个contig中，其中38.5%的基因位于contig27中，19.2%的基因位于contig24。选取XF-1、NCD-2这两株与DNKAS遗传距离存在差异的菌株基因组进行生物膜形成相关基因的同源性比较，两两比较结果与进化树结果相似，即DNKAS的生物膜功能基因与NCD-2的基因同源性更高，见表3，只在PTS-Glc-EIIA，crr基因存在差异，NCD-2J菌株缺少DNKAS位于contig25的相同基因。

表2 DNKAS菌株生物膜形成相关基因

表3 菌株间生物膜形成基因的同源性比对

3 讨 论

化学除草剂在现代农业的高产丰收中起到十分重要的作用，但长期大剂量连续喷施产生了诸多问题。目前，利用微生物防除列当杂草的研究日益增多。已报道的具有防除列当潜能的微生物主要是列当病原菌、寄主植物共生菌或其他微生物，包括镰刀菌[9]、根瘤菌[10]、假单胞菌[11]和丛枝菌根真菌[12]等。Nemat Alla等利用盆栽试验证明尖孢镰刀菌FoxyⅠ和FoxyⅡ的孢子悬浮液对锯齿列当和分枝列当有显著防效，将两种菌的剂型加工为固态颗粒也有相同效果[13]。Mabrouk等试验发现接种根瘤菌P.1236和P.SOM可显著降低豌豆根部锯齿列当的萌发率，增加列当块茎的坏死率[14]。枯草芽胞杆菌（B.subtils）菌株DNKAS作为一种高效生防菌株，已完成列当防除的田间实验。DNKAS菌株绿色环保，对人畜无毒无害，具有较高的生防潜力，有待进一步防效验证。

本次参与比对的菌株多作为益生菌进行过报道。UD1022是美国特拉华大学报道的一株根际促生细菌[15]，NCD-2、BAB-1、BSD-2、XF-1为河北农林科学院、河北工业大学、云南农业大学研发的生防菌，主要用于棉花黄萎病、番茄灰霉病、十字花科根肿病等的防治[16-19]。与DNKAS全基因组进化分析亲缘关系最近的NCD-2、UD1022均是定殖能力强的菌株，因此DNKAS可有效发挥生防作用，推测也与其易于定殖有关。通过基因组基本特征的统计，DNKAS菌株编码4 217个基因，数目最多，通过后续基因注释可继续深入挖掘其生防机理。

对生防微生物全基因组序列进行比较和同源基因分析是获取其功能相关核心基因的常用方法。高圣风将胡椒瘟病生防菌B.subtilsVD18R19与B.Subtilis 168、B.subtilisW23、B.velezensisFZB42进行比较分析，发现4个菌株共有基因2 745个，特有基因1 055。生防菌VD18R19的特有基因为397个，含有6个抑菌代谢产物编码基因簇，与模式菌株168具有极高的同源性[20]。王晓宇在对B.subtils BS-916的全基因组测序分析发现，与其它已测序全基因组芽孢杆菌相比，其GC含量最高，达到46.4%，含有多种典型的抗菌物质编码基因簇[21]。随着测序菌株数量及测序深度的不断提高，获得的基因资源在不断积累，从菌株共有基因中获取的关键基因数量也在不断增多，通过同源基因比较可深入挖掘与生物性状相关的关键基因位点。

生物膜是细菌生长过程中为适应周围环境，而分泌的胞外聚合物，具有一定三维结构，使微生物群体能附着于固体或生物表面[22]。oxyR是细菌抗氧化系统OxyR调节蛋白的编码基因，oxyR调节子可抑制细菌外膜蛋白相变，增强菌株抗逆性。SinR是Spo0A-P的主要调节子编码基因，受其调控的Spo0A基因起到中央转录监管作用，控制着包括生物膜基质所必需的基因表达在内的100多个基因的表达。SlrR基因表达水平的高低调控SlrR-SinR开关，介导抑制自溶素产生，决定着维持生物膜中细胞链结构的完整性。DNKAS菌株的这些基因与NCD-2相似性一致，二者仅在PTS-Glc-EIIA蛋白组分存在差异，DNKAS菌株具有2个，而NCD-2只有1个该基因。PTS-Glc-EIIA是由crr基因编码的PTS系统葡萄糖特异性EIIA组分，是依赖于磷酸烯醇丙酮酸的糖磷酸转移酶系统，与糖类物质在细胞膜上的转运摄入有关，因此菌株间对碳水化合物的转运能力可能存在差异。

4 结 论

定殖能力是芽孢杆菌发挥其生防功能的重要前提，对其生物膜形成分子机制的解读是研究生防作用的关键所在，全基因组测序及比较基因组分析是实现这一目标的有力工具。本研究对菌株DNKAS进行全基因组测序和比较分析，为枯草芽孢杆菌的功能基因组学研究提供了参考数据，为深入研究其定殖特性和作用机制，以更有效地开发和应用芽孢杆菌除草剂提供依据。