钱雨可，于金英，汪 冶

（1.丽水学院生态学院，浙江 丽水 323000；2.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018）

松树萎蔫病（pine wilt disease，PWD）是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner and Buhrer）Nickle（Nickle，1970），pine wilt nematode，PWN）引起的松树病害，松树感染松材线虫（B.xylophilus）之后，发病初期症状表现为松针的黄化和萎蔫[1]。1982年我国在南京中山陵首次发现该病[2]，松材线虫与美国白蛾、松圆蚧一同列为森林三大病源性害虫，属国际重要检疫对象，其中松材线虫被林业部列为森林害虫之首。因此，寻找能够高效杀灭松材线虫的生物防治措施，保护松属植物任务迫在眉睫。

Metcalf[3]研究发现：不仅曲霉属真菌对线虫具有毒杀作用，而且在工业领域中，黑曲霉（Aspergillus niger）及其次生代谢产物（如小分子有机酸、杂环化合物等[4]）在抗线虫领域有较广泛的应用。

笔者利用黑曲霉发酵产物，采用室内浸渍法测定其次生代谢产物对松材线虫的毒杀作用，旨在为杀松材线虫新型生物农药制剂的研究和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

黑曲霉（A.niger），保存地：丽水学院生态学院天然药物化学分析实验室。

1.1.2 供试线虫

采用贝尔曼（Baermann）漏斗法从马尾松疫木中分离松材线虫，并经浙江省林业科学研究院鉴定为B.xylophilus。对松材线虫进行同期化处理[5]，线虫卵经离心分离，接入长满灰葡萄孢菌的培养基28℃恒温培养2～3 d后得到处于L4期线虫，用以毒力测定试验。

1.1.3 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），121℃灭菌20 min。

1.1.4 主要试剂

DMSO（AR）、乙酸乙酯（AR）、M9缓冲液、线虫裂解液。

1.1.5 实验设备

TG16G离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、KS 4000i control恒温摇床（IKA）、R-210旋转薄膜蒸发仪（BUCHI）、旋涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）、生化培养箱（上海森信实验仪器有限公司）、SQP电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

用接种环挑取保存于试管斜面的黑曲霉划线接种于PDA培养基，于28℃恒温培养3～4 d，待菌落长满整个平板。

1.2.2 发酵产物的制备

用灭菌刀切一小块（1 cm×1 cm）长有黑曲霉菌落的培养基置于PDB中，180 r·min-1、28℃条件下培养3 d。发酵液用四层纱布过滤，取150 mL待用。剩余发酵液加入等体积乙酸乙酯萃取，上层有机相经减压浓缩得到发酵产物，用1%DMSO溶解有机相溶质制成母液。发酵液与母液用针筒过滤器（孔径0.22 μm）过滤除菌，置4℃冰箱备用。

1.2.3 试验分组及毒力试验

样品组：将黑曲霉发酵液用无菌水稀释0、2、4、8、16倍，各取500 μL于24孔板中。母液用1%DMSO稀 释 至 浓 度 为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1，各取500 μL于24孔板中。

对照组：取500 μL 1%DMSO于24孔板中。

采用浸渍法[6]测定各菌株发酵产物对松材线虫的毒杀作用。样品组和对照组分别加入500 μL浓度为100条·mL-1的松材线虫，于28℃条件下放置12、24、36、48 h，观察线虫的存活和死亡数量，并计算死亡率与校正死亡率[7-8]，每组实验重复3次。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2016软件进行整理，运用GraphPad Prism8软件进行数据处理与单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

经1.2.2节制备发酵产物和1.2.3节毒力实验测定，发现黑曲霉的杀松材线虫活性显著，其发酵液稀释16倍后，经12 h处理后的线虫平均死亡率达89.04%，48 h后线虫平均死亡率仍可达99.24%（表1）。其胞外代谢产物经24 h和48 h处理后的LC50值 分 别 为0.075 5 mg·mL-1和0.071 2 mg·mL-1，在1 mg·mL-1处理24 h后杀虫效果即可达100%（图1）。通过GraphPad Prism8软件对数据进行拟合得到黑曲霉代谢产物对松材线虫的半致死浓度及毒力回归方程，结果见表2。

表1 黑曲霉发酵液杀松材线虫毒力测定

图1 黑曲霉发酵产物抗松材线虫活性

表2 黑曲霉次生代谢产物对松材线虫的致死浓度效应

3 讨论

在众多植物寄生线虫生防菌中，曲霉属真菌代谢产生的毒素对线虫具有防治作用，其中黑曲霉作为实验与工业上廉价易得的曲霉属真菌广泛应用于食品、制药等领域。其对植物寄生线虫的致死作用已有文献报道，如丰波[9]研究发现黑曲霉发酵液对根结线虫的作用为2 h致死率达94%，线虫卵孵化抑制率达86%，且其活性物质为非蛋白质、不挥发性成分，易溶于有机溶剂。朱晓峰等[4]通过分析黑曲霉发酵液中的有机酸成分，发现其发酵液中除草酸外还有其他小分子化合物对甘薯茎线虫和南方根结线虫有活性。李颂等[10]研究发现黑曲霉代谢产物参与了番茄体内与防御反应相关的代谢过程，增强了番茄植株对根结线虫病的防效。

通过黑曲霉发酵得到其次生代谢产物，并对其发酵液与萃取有机相进行室内毒力测定，首次发现其代谢产物对松材线虫具有显著杀虫活性。松材线虫经黑曲霉发酵液给药12 h后致死率达100%，经发酵液16倍稀释给药12 h后致死率仍可达89.04%，与上述参考文献中涉及的抗虫活性无显著差异，试验结果具有一定的可信度。此外，发现黑曲霉的活性成分存在于发酵液萃取有机相中（萃余相经测定无明显活性），24 h的LC50值为0.075 5 mg·mL-1，杀虫活性优于目前治疗松材线虫病药剂阿维菌素（IC500.134 6 mg·mL-1）[11]。

笔者对黑曲霉发酵液毒杀松材线虫的作用进行了初步研究，今后还需要对其发酵液有机相进一步分离纯化发现活性先导化合物，并对杀虫活性成分的毒杀松材线虫的作用机制方面进行深入研究。