高 晶 魏益谦 孟智睿 邵紫萱 李 丽 张建军 王景霞

(北京中医药大学，北京，100029)

血脂异常(Dyslipidemia)指血浆中脂质量和质的异常，通常指血浆中总胆固醇(Total Cholesterol，TC)和(或)三酰甘油(Triacylglycerol，TG)升高，也包括高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)降低。由于脂质不溶于水或微溶于水，在血浆中与蛋白质结合以脂蛋白的形式存在，因此，血脂异常实际上表现为脂蛋白异常血症(Dyslipoproteinemia)[1]。长期高脂饮食及持续血脂异常会增加动脉粥样硬化的危险，并可导致脑血管病、心血管病尤其是冠心病及周围血管病的发生，因此积极控制预防具有重要意义[2]。本病可归属于中医学“脂浊”范畴，中医学认为本病多为本虚标实，主要的病机是肝、脾、肾虚，痰浊瘀血，阻滞经脉，而致膏脂布化失度[3]。沙苑子为豆科植物扁茎黄芪(AstragaluscomplanatusR.Br.)的干燥成熟种子，是中医临床常用的温补肾阳的药物，主要针对肾阳不足，痰浊日久而导致的高脂血症，具有温阳化浊的作用[4-5]。沙苑子的化学成分非常丰富，包括多肽类、黄酮类、酚类、鞣质、三萜类、生物碱类、甾醇等[6]。课题组前期研究显示沙苑子黄总黄酮具有良好的调节血脂的作用，能够降低高脂大鼠血清TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)水平，升高HDL-C水平，能抑制肝脏固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c，SREBP-1c)表达，上调过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor α，PPARα)表达，减少TG在肝脏的沉积，从而达到调脂作用[7-9]。沙苑子苷A是沙苑子总黄酮中含量较高的一种黄酮类成分[10]，本研究采用人L02肝细胞体外脂肪变性模型，探讨沙苑子苷A对脂肪变性细胞损伤、TG脂肪酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)、相关核受体过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferators-activated Receptor，PPAR)以及炎症介质的影响，以期进一步明确沙苑子降血脂的物质基础及其调节血脂的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人正常肝L02细胞株，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0111。

1.1.2 药物 沙苑子苷A(Apexbio公司，美国，批号：N240321337769)。

1.1.3 试剂与仪器 高糖DMEM培养基(Hyclone公司，美国，批号：sh30284.01)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：T4299)，青链霉素(Invitrogen公司，美国，批号：V900929)，胎牛血清(Gibco公司，美国，批号：V900933)，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)(Gibco公司，美国，批号：10099-141)，棕榈酸钠(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：P9575)，油酸钠(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：07501)，二甲基亚矾(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：DMSO)，蛋白裂解液(Sigma公司，美国，批号：r0278)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法蛋白含量测定试剂盒(批号：KGP902)、TG试剂盒(批号：A110-1-1)、TC试剂盒(批号：A111-1-1)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒(批号：A003-1-2)、过氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)试剂盒(批号：A001-3-2)均购于南京建成生物工程研究所，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：APOAF-20TST)，实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)检测主要实验材料：引物(北京睿博兴科生物技术有限公司合成)，Trizol(Invitrogen公司，美国，批号：15596018)，核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)抑制剂[Fermentas(MBI)公司，美国，批号：eo0382]，RNase-free H2O(Fermentas(MBI)公司,美国，批号：eo0521)，转录酶、qPCR Mix(APEXBIO公司，美国，批号：K1070-5000)，ATGL抗体(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：P1872)，PPAR-α(Abcam公司，英国，批号：epr18516)，PPAR-γ(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：SAB4502262)，白细胞介素-6(Interleukin，IL-6)(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：I1395)抗体，肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α抗体(Sigma-Aldrich公司，美国，批号：RAB0522)，抗兔IgG辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)(Cell Signaling公司，美国，批号：ab6721)，超净工作台(青岛海尔股份有限公司，型号：HCB-1300V)，二氧化碳恒温培养箱(Thermo公司，美国，型号：HERAcell 2401)，高速低温离心机(Eppendorf公司，德国，型号：5424r)，倒置显微镜(Olympus公司，日本，型号：CKX31)，EPICS-XL型流式细胞仪(Beckman-Coulter，美国，型号：XL-MCL)，全自动生化分析仪(Rayto公司，美国，型号：CHEMRAY 120)，酶标仪(Thermo公司，美国，型号：1410101)，7500实时定量PCR仪(美国BIO-RAD公司，美国，型号：7500)，电泳仪(Bio-Rad公司，美国，型号：1645050-OG)、转膜仪(Bio-Rad公司，美国，型号：1704150)，凝胶成像系统(UVP公司，美国，型号：e142362)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 根据L02细胞的给药浓度不同设置对照组、模型组和受试药低剂量、中剂量、高剂量组。L02细胞用含10%胎牛血清Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)于37 ℃、5% CO2培养箱培养，传代。于96孔板和(或)24孔板中加入L02细胞，培养至融合80%，加入含有1% BSA、1 mmol/L的游离脂肪酸(Free Fatty Acids，FFA)混合液(油酸∶软脂酸为2∶1)的DMEM培养基，构建脂肪肝细胞模型。

1.2.2 给药方法 受试药细胞分别加入1、10、50 μmol/L沙苑子苷A工作液(沙苑子苷A粉末溶于二甲基亚砜配制)预处理24 h后，再加入FFA混合液孵育24 h，随后测定相应的指标。

1.2.3 指标检测与方法

1.2.3.1 流式细胞仪检测L02细胞凋亡 收集各组细胞，细胞用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline，PBS)洗涤2次。重悬细胞，用10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI避光常温孵育5 min，流式细胞仪分析测得数据。

1.2.3.2 流式细胞仪检测L02细胞脂肪堆积 收集各组细胞，冰PBS洗涤2次×10 min，重悬于1 μmol/L尼罗红染液1 mL，室温避光振荡染色30 min，冰PBS洗涤2次，重悬于500 μL PBS，流式细胞仪(490 nm excitation/570 nm emission)随机计数10 000个细胞，检测其荧光强度，各处理组检测荧光强度与对照组比较，计算倍数变化。

1.2.3.3 L02细胞TG、TC、MDA含量和SOD活力的测定 收集各组细胞，严格按照试剂盒说明书，应用全自动生化分析仪检测TG、MDA含量、SOD活性水平。

1.2.3.4 实时荧光PCR检测ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α mRNA表达 提取各组细胞总RNA，根据产品说明书操作。用生物分光光度计测定RNA浓度和纯度。取2 μg RNA样本，用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，并以此为模板进行PCR扩增反应。逆转录和PCR条件按照试剂盒说明书设置。PCR进行35～40个循环：预变性95 ℃，2 min；变95 ℃，30 s；58 ℃退火，30 s；72 ℃延伸30 s。ATGL上游引物为5′-ACATCCGGTGGATGAAGGAG-3′，下游引物为5′-GGCAGTGCCTCTCTGTAGG-3′；PPARα上游引物为5′-ACGATTCGACTCAAGCTGGT-3′，下游引物为5′-AAACGAATCGCGTTGTGTGA-3′；PPARγ上游引物为5′-CTAAAGAGCCTGCGAAAGCC-3′，下游引物为5′-GGCGGTCTCCACTGAGAATA-3′；TNF-α上游引物为5′-CTGCACTTTGGAGTGATCGG-3′，下游引物为5′-AGGGTTTGCTACAACATGGG-3′；IL-6上游引物为5′-AAGCCTCCCAGTGCAAGATT-3′，下游引物为5′-ATGCATGCTTGTCTTGCCTT-3′；GAPDH上游引物为5′-CTCATGACCACAGTCCATGCC-3′，下游引物为5′-TTCCCGTTCAGCTCAGGGAT-3′。实时定量PCR结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.2.3.5 蛋白质印迹(Western Blotting)法检测ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α蛋白表达 收集各组细胞，蛋白裂解液裂解细胞，4 ℃离心(离心半径8 cm、转速12 000 r/min、时间15 min)取上清液，BCA法测定蛋白含量，总蛋白50 μg上样，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Filter Membrane，NC膜)上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭后加入1∶1 000稀释的相应的一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗3次，加入1∶2 000 HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗3次后，用Western Blotting荧光检测试剂盒显影、定影。结果用图像分析仪分析。

2 结果

2.1 沙苑子苷A对脂肪变L02细胞凋亡的影响 对照组的细胞凋亡率为(5.43±1.93)%，而模型组L02细胞的凋亡率为(41.54±11.17)%，显著升高(P<0.01)。沙苑子苷A低剂量、中剂量、高剂量组的细胞凋亡率分别为(33.40±6.11)%、(26.61±5.54)%、(15.73±3.51)%，均有显著降低(均P<0.05)。见图1。

图1 不同浓度沙苑子苷A对L02细胞凋亡的影响

2.2 沙苑子苷A对肝脂肪变L02细胞脂肪堆积的影响 与对照组比较，模型组的脂肪堆积明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A低剂量、中剂量、高剂量组L02细胞脂肪堆积均减少，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图2。

图2 不同浓度沙苑子苷A对L02细胞脂肪堆积的影响

2.3 沙苑子苷A对脂肪变L02细胞内TG、TC含量的影响 与对照组比较，模型组L02细胞TG、TC含量均明显增加，差异有统计学意义(均P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A中、高剂量L02细胞TG含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，沙苑子低剂量、中剂量、高剂量L02细胞TC含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 沙苑子苷A对L02细胞内TG、TC含量的影响

2.4 沙苑子苷A对脂肪变L02细胞内MDA含量和SOD活力的影响 与对照组比较，模型组L02细胞MDA含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A中、高剂量L02细胞MDA含量均显著降低，差异有统计学意义(均P<0.01)。与对照组比较，模型组L02细胞SOD活力水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；沙苑子低剂量、中剂量、高剂量L02细胞SOD活力水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 沙苑子苷A对L02细胞内MDA、SOD水平的影响

2.5 沙苑子苷A对ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组L02细胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γmRNA表达均显著升高(均P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A低剂量、中剂量、高剂量组L02细胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γmRNA表达均显著升高(P<0.05，P<0.01)。与对照组比较，模型组L02细胞TNF-α、IL-6 mRNA表达均显著升高(均P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A低剂量、中剂量、高剂量组L02细胞TNF-α、IL-6 mRNA表达均显著降低(均P<0.01)。见表3。

表3 沙苑子苷A对TG代谢相关基因表达的影响

2.6 沙苑子苷A对ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组L02细胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γ蛋白表达均显著升高(均P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A低剂量、中剂量、高剂量组L02细胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γ蛋白表达均显著升高(P<0.05，P<0.01)。与对照组比较，模型组L02细胞TNF-α、IL-6蛋白表达均显著升高(均P<0.01)；与模型组比较，沙苑子苷A低剂量、中剂量、高剂量组L02细胞TNF-α、IL-6蛋白表达均显著降低(均P<0.01)。见表4，图3。

表4 沙苑子苷A对TG代谢相关蛋白表达的影响

图3 不同浓度沙苑子苷A对TG代谢相关蛋白表达的影响

3 讨论

对沙苑子黄酮类成分的研究起源于20世纪80年代，陈妙华和刘风山[11]首次提取出沙苑子特有黄酮成分，命名为沙苑子苷。目前已经从沙苑子中提取到超过16种的黄酮类化合物[6，12]，如沙苑子苷A、沙苑子苷B、沙苑子苷C、沙苑子杨梅苷等。目前国内外学者对沙苑子总黄酮的药理作用研究较多，但是对单体成分的药理研究还未见报道。课题组前期研究用1 mmol/L游离脂肪酸混合物(油酸:棕榈酸为2:1)作用于人肝细胞L02细胞24 h建立了脂肪变肝细胞模型，本实验利用此模型观察沙苑子苷A对脂肪变L02细胞的影响，探讨其降脂作用及分子机制。

肝脏参与脂质代谢过程中的多个重要环节，摄取及合成脂肪酸，加工、贮存、氧化分解及输出脂质，当肝脏获得脂肪酸的量超过其处理能力时，就会造成脂肪沉积[13]。本实验结果显示FFA模型组L02细胞脂肪堆积明显增加，TG、TC含量升高，MDA含量升高，SOD活性下降，细胞凋亡率增加，给予沙苑子苷A能显著减少脂肪堆积，降低TG、TC、MDA含量，增加SOD活性，降低细胞凋亡率，减轻脂毒性造成的肝细胞损伤。说明沙苑子苷A是沙苑子降脂保肝的有效单体成分之一。

ATGL是机体脂质代谢过程中的重要脂肪酶之一，是TG水解的第一步，主要把TG分解成甘油二酯，除在脂肪组织高表达外，ATGL也在骨骼肌、心肌、肝脏等非脂肪细胞中表达[14]。研究发现其不仅在脂肪组织脂解过程中处于关键脂肪酶的角色，而且在非脂肪组织的脂质和能量代谢过程中也发挥了重要的作用[15]。尽管肝脏中ATGL的表达与脂肪组织相比较低，但是已经证明ATGL是主要的肝脏TG水解酶，Ong等[16]研究显示，由腺病毒介导的肝脏ATGL基因敲除小鼠体内出现肝脂肪变性，原代肝细胞内TG降解速率也受到抑制；与此同时，还发现ATGL过表达小鼠体内脂肪酸氧化增加，改善肝脏的脂质代谢[17]。本实验研究显示，FFA诱导L02细胞中ATGL的mRNA和蛋白的表达量比正常细胞中有明显的提高，这说明了当肝细胞中内积累了大量TG时，细胞中脂肪分解限速酶ATGL的表达大量增加，细胞通过自身调节来代谢TG，使细胞恢复正常，给予沙苑子苷A能使细胞内ATGL mRNA和蛋白表达量进一步提高。

PPARs是调控肝脏脂质代谢核受体家族转录因子之一，PPARs有3种亚型：PPARα，PPARβ/δ和PPARγ[18]。其中PPARα在肝脏中高度表达，PPARα的激活在TG的合成以及氧化等代谢途径发挥重要作用[19]。PPARγ在脂肪中过表达，促进脂肪细胞分化代谢[20]，但是研究发现，高脂血症模型大鼠肝脏的PPARγ的蛋白表达水平显著降低[21]，非酒精性脂肪肝患者经过降脂药非诺贝特治疗后，观察组肝组织PPARγ2 mRNA水平显著高于对照组，说明非诺贝特可能通过提高肝组织PPARγ2表达，使脂肪从肝脏转移并消耗[22]。ATGL的过表达可以提高PPARα的活性，激活PPARα信号通路和脂肪酸通道，进而促进脂质代谢[23]。在ATGL缺陷型小鼠中，可以通过用PPARα激动剂治疗来恢复缺陷的PPARα活化[24-25]。用PPARγ激动剂罗格列酮饲喂小鼠，其ATGL mRNA和蛋白表达都显著增加,通过对ATGL基因启动子的分析证明ATGL受PPARγ的直接调控[26]。本实验研究显示，FFA诱导L02细胞中PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白表达量比正常细胞中有明显的提高，这说明了当肝细胞中积累了大量TG时，细胞中PPARα、PPARγ的表达会自行上调，细胞自动调节来分解TG使细胞恢复正常，给予沙苑子苷A会使细胞内PPARα、PPARγ表达量进一步提高，PPARα的上调幅度比PPARγ的幅度略小。说明沙苑子苷A可能通过上调PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白的表达，使ATGL表达增加，促进肝脏TG的水解，减轻肝脏脂肪的沉积。

TNF-α和IL-6是2个与肝脏脂肪沉积关系密切的细胞因子，与肝组织的炎症、坏死和纤维化正相关[27]。Stienstra等[28]研究发现PPAR-α基因敲除小鼠和野生型小鼠用高脂饮食喂养6个月后，PPAR-α基因敲除小鼠中IL-6、TNF-α等多种炎症介质的表达比野生型小鼠显著升高。PPARγ通过降低基质金属蛋白酶9的活性，抑制炎症介质IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达[29]。本实验研究显示，FFA诱导L02细胞中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达量比正常细胞中有明显的提高，这说明了当肝细胞中脂肪大量沉积会造成细胞受损，引起细胞的炎症反应，给予沙苑子苷会使细胞内的IL-6和TNF-α表达显著降低，说明沙苑子苷A能减轻脂肪变性肝细胞的炎症反应。

综上所述，本研究从体外实验证实沙苑子苷A是沙苑子降脂的有效单体成分之一，其可能通过上调PPARα、PPARγ的表达，使ATGL表达增加，促进肝脏TG的水解，减少肝脏脂肪的沉积，缓解氧化应激，降低促炎TNF-α和IL-6的分泌，减轻炎症反应，从而恢复肝细胞的正常功能。