袁贵云，孙学广

(1.贵州大学 贵州省森林资源与环境研究中心/贵州省高原山地林木培育重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025)

丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，简称AM)真菌作为土壤生态系统中分布最为广泛的真菌类群之一，可以与超过80%的陆生植物建立互惠共生关系。AM真菌-植物共生体的形成可通过提高宿主植物对矿质营养的吸收，增强宿主植物对不良环境的耐受性来促进植物生长。

有研究发现，AM真菌可以直接或间接地调节宿主的代谢活动。徐丽娇等发现AM真菌-玉米共生体可以通过分泌物调控碳磷代谢相关基因的表达,帮助玉米抵御低磷胁迫；李涛等发现AM真菌可以增加水孔蛋白基因表达，改善植物的水分代谢，增强植物的抗旱能力；于洋等研究发现不同AM真菌对宿主植物的次生代谢过程及其产物种类、含量的影响存在差异。然而，以往研究主要关注了AM真菌对宿主特定代谢物或代谢物类群的影响，有关AM真菌对宿主植物代谢组的整体调控仍缺乏认知。

白三叶草()适应性强，分布广泛，是重要的牧草。已有研究表明接种AM真菌会通过增强宿主植物养分吸收能力、积累更多的代谢底物(如蔗糖)或生长调节物质促进白三叶草生长，但目前有关AM真菌对白三叶草代谢的影响还是未知的。基于此，本研究采用UPLC-MS/MS技术从代谢组角度研究AM真菌接种对白三叶草代谢物积累的影响，以期为AM真菌在白三叶草培育中的应用提供参考。

1 材料与方法

丛枝菌根真菌菌剂：摩西管柄囊霉()(BGC NM01A)，以玉米为宿主扩繁得到，孢子浓度为84个/g。白三叶草(海发Haifa)购自百绿国际草业(北京)有限公司。

1.1 试验设计

将白三叶草种子置于浓硫酸(98%)中表面消毒10 min，随后用无菌水冲洗3次。消毒过的种子置于湿滤纸上暗培养，出芽3 d后转至装有灭菌石英砂的花盆中培养(浇有Hoagland营养液)，每盆1株，15 d后进行接种处理。

设置接种(M)和不接种(NM)2个处理，接种处理植株每株接种5 g菌剂，不接种处理接种5 g灭菌(121 ℃，30 min)过的菌剂。每处理14株，其中5株用于生物量测定，其余植株用于代谢组分析(仅茎叶部分)及侵染率测定。

盆栽置于人工气候箱中培养(光照/黑暗：14 h/10 h；光照强度12 000 lx；温度25 ℃)，定期补水和霍格兰营养液，90 d后收样。

1.2 生物量及AM真菌侵染率测定

随机选取5株白三叶草用于生物量测定。从根茎连接处将植株剪开，分别测定茎叶及根系鲜重，同时换算根茎比。随后参照Koske等的方法将根系进行透明、酸化及染色处理。侵染率测定方法参照Sun等的方法。

1.3 代谢组分析

分别剪取剩余植物的茎叶组织，每3株三叶草茎叶混为1个样品(n=3)。

对样品进行真空冷冻干燥，随后用球磨仪研磨至粉末状，混匀后称取100 mg粉末加入1.0 mL提取液(70%甲醇)，4 ℃过夜浸提。离心，取上清用微孔滤膜过滤后用于UPLC-MS/MS分析(交由迈维代谢分析)。

利用软件 Analyst1.6.3处理质谱数据。基于迈维代谢自建数据库MWDB及代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性。代谢物定量利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成。

根据(O)PLS-DA模型变量的变量权重值(variable importance for the projection,VIP)辅助筛选差异积累代谢物。代谢物在对照组和实验组中差异为2倍以上或0.5倍以下，同时VIP值≥1，则认为差异显著。利用KEGG 数据库对差异代谢物进行注释及通路富集。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2019对侵染率及生物量数据进行整理，使用IBM SPSS statistics 25.0 进行数据的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 白三叶草菌根侵染情况及生物量

接种后3个月，摩西管柄囊霉与白三叶草根系形成了良好的共生关系，根系内可见大量菌丝和丛枝结构，未接种处理则无菌根形成(图1)。接种摩西管柄囊霉促进了白三叶草生长，其根系和茎叶生物量均显著高于未接种处理(<0.05)(表1)。但接种处理未显著改变根茎比。

表1 白三叶草生物量Tab.1 Biomass of T. repens

注：a为接种处理；b为未接种处理；白色箭头指示为丛枝结构，标尺=20μm；c为侵染率。图1 摩西管柄囊霉对白三叶草根系的侵染情况Fig.1 Infestation of the root system of T. repens by F.mosseae

2.2 接种摩西管柄囊霉对白三叶草代谢的影响

采用UPLC-MS/MS技术共从白三叶草茎叶组织中鉴定到代谢物671种，分属氨基酸及衍生物(81种)、苯丙素(46种)、醇类(15种)、多酚(7种)、酚胺(5种)、核苷酸及衍生物(53种)、花青素(23种)、黄酮(68种)、黄酮醇(31种)、黄酮类(23种)、黄烷酮(15种)、醌类(2种)、生物碱(29种)、糖类(19种)、萜类(22种)、维生素及衍生物(19种)、异黄酮(14种)、吲哚及衍生物(4种)、有机酸及衍生物(93种)、原花青素(1种)、甾体(5种)、脂质(71种)、其他(25种)等类别，其中以花青素(24.94%)、有机酸及衍生物(19.98%)、脂质(12.66%)、苯丙素(10.67%)的相对含量最高(图2-a；此处相对含量值为所有样品中对应物质相对含量的均值)。

图2 不同接种处理下白三叶草茎叶组织代谢物组成(a)及差异代谢物数量(b)Fig.2 Metabolite composition (a) and differential metabolite quantity (b) in stem and leaf tissues of T. repens under different inoculation treatments

续表2

接种处理改变了白三叶草茎叶代谢物的积累。与未接种处理相比，接种AM真菌后共检测到差异代谢物93种，其中52种上调，41种下调(图2-b)。差异代谢物中以黄酮类及衍生物(包括黄酮类、黄酮、黄酮烷、黄酮醇和异黄酮)最多，共22种，且全部上调。下调代谢物则以脂质(15种)和核苷酸及衍生物(10种)最多(表2)。KEGG注释结果显示，差异代谢物主要参与淀粉和蔗糖代谢、异黄酮生物合成、醛固酮合成及分泌、嘌呤代谢等生物学过程(图3)。

表2 差异积累代谢物(M/NM)Tab.2 Differential accumulation of metabolites (M/NM)

图3 差异代谢物KEGG富集结果Fig.3 KEGG enrichment results of differential metabolites

3 结论与讨论

本研究发现，接种摩西管柄囊霉显著促进了白三叶草生长，这与以往的研究结果相似。AM真菌对宿主植物的促生效应可能与其能改善宿主植物的营养状况，增强宿主植物对P、N等养分的吸收效率有关。

已有研究表明，AM的形成可改变宿主代谢物的积累。贺学礼等研究发现在适宜的水肥条件下接种AM真菌会显著提高丹参()植株的酮含量。韩冰洋等发现接种AM真菌对长果颈黄芪()根系中的黄酮类和皂苷类成分含量有显著影响，并指出接种AM真菌是一种能有效提高植物黄酮类成分含量的方法。Welling等、Kapoor等分别对AM真菌影响植物萜类化合物积累的机制进行了综述，进一步论证了AM真菌-植物共生影响了植物中萜类化合物的生产，他们推测这些萜类化合物可能对植物生长有重要作用。本研究同样发现接种AM真菌后可增加代谢物的积累。本研究检测到黄酮、异黄酮等52种上调表达的差异代谢物，其主要参与淀粉和蔗糖代谢、异黄酮生物合成等生理过程，可能在调节植物生长、植物防御等方面起重要作用。

黄酮类及衍生物是一类植物根系重要的代谢产物，有研究发现其可作为菌根共生体建立过程中的信号物质，对孢子萌发、菌丝生长、菌根真菌的侵染等有促进作用。同时，该类物质(特别是异黄酮类物质)是衡量牧草营养价值的重要指标。本研究发现接种AM真菌后的白三叶草会积累更多的黄酮类及衍生物(含异黄酮)，表明AM真菌可提高白三叶草的营养价值。

有机酸是植物常见的次生代谢物种类，其可以经酸化、螯合、离子交换或还原等途径将根系难溶性养分转化成易被植物吸收的有效成分，如难溶性磷，促进植物生长发育。本研究中有机酸及衍生物(19.98%)相对含量较高，仅次于花青素(24.94%)，且其上调比例高于下调比例，表明接种AM真菌可能提高了白三叶草对土壤中难以吸收的矿质营养的获取能力。

维生素及衍生物在植物体的生命活动中发挥着重要作用。已有研究证实核黄素(Riboflavin，VB)等在促进植物体生长、调节次生代谢产物的生物合成等方面有重要作用，本研究中观测到的AM真菌对白三叶草的促生效应可能与核黄素等差异代谢物质积累增加有关。另外，核黄素及其衍生物(如FMN和FAD)是植物光合作用、能量生成和氧化还原代谢过程中必不可少的组成部分，韩金龙等发现杜梨()叶片的抗氧化酶活性和抗氧化物质含量增加，主要与核黄素参与的活性氧代谢相关。本研究中检测到的核黄素处于上调表达，表明接种AM真菌可能会增强白三叶草体内的抗氧化酶活性并促进营养物质的积累。

综上，本研究发现AM真菌可促进白三叶草生长并可调节其代谢，接种后白三叶草积累了更多的黄酮类、维生素及衍生物等具有营养价值的代谢物，这对后续牧草生产中施用AM真菌来增产增效有重要指导意义。