段治宇，王效蕊，梁婷婷，李青山，3，梁泰刚

(1.山西医科大学药学院，山西 晋中 030600；2.山西省中医院，山西 太原 030012；3.山西中医药大学，山西 晋中 030619)

近几十年来，有机锡化合物在工农业生产中被广泛应用，如船体防污漆及木材防腐剂等。在使用过程中，该类化合物会不可避免地向环境中排放[1]。然而，大多数有机锡化合物具有高生物毒性，这些化合物可通过小肠或皮肤等途径进入人体。特别是三取代体最易被吸收，并主要分布在肝、肾和脑部[2]。其中，作为三丁基氯化锡在人体内的主要的降解产物，二氯二丁基锡对人体产生的危害同样引起人们的重视。

肝脏作为人体的主要代谢部位，在分子解毒的过程中可能会生成过量的有毒活性氧。这会对肝细胞造成氧化损伤，严重时会损害这一关键器官的功能[3]。而抗氧化剂的使用可保护肝脏免受自由基介导的损伤。有研究发现，一些具有抗氧化作用的天然活性产物对肝损伤的治疗具有显著效果[4 - 5]。

青藤碱(sinomenine，SIN)是从防己科植物青藤的干燥藤茎中提取的生物碱，具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[6]。此外，SIN具有抗氧化作用[7]。本课题组前期研究证实了SIN可以保护H2O2导致的肝HL02细胞损伤。

本研究通过建立二氯二丁基锡诱导的HL02细胞损伤模型观察SIN对细胞的保护作用及对凋亡相关信号通路的影响，旨在进一步阐明SIN发挥保护作用的机制，为深入探讨其潜在药用价值研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器光学倒置显微镜(OPTECBDS200-PH，重庆Optec Instrument公司)；酶标仪(Thermo Scientific)；台式低速离心机(TD5A-WS，长沙湘仪有限公司)；高速冷冻离心机(TGL-16gR，上海安亭科学仪器厂)；荧光倒置显微镜(IX-51，Olympus)；流式细胞仪(BD-C6，USA)；实时定量PCR仪(Step One，Applied Biosystems)。

1.2 细胞株HL02细胞株来自中国科学院细胞库。

1.3 主要试剂二氯二丁基锡(货号205494)购自美国Sigma公司；青藤碱(纯度>97%，货号S302249)购自上海aladdin公司；吖啶橙(AO，货号0360-50G)、溴化乙锭(EB，货号0492-5G)均购自美国Amerisco公司；活性氧(ROS)检测试剂盒(货号C1300-1-2)购自北京ApplyGEN公司；双染凋亡检测试剂盒(货号KGA106)购自江苏keyGEN BioTECH公司；RNA提取试剂盒(货号9753Q)购自北京Takara Bio公司；兔抗cleaved caspase-3(货号9664)、caspase-9抗体(货号9502)均购自美国Cell Signaling公司。RPMI 1640培养基(货号31870082)、胎牛血清(FBS，货号10100147)、青链霉素双抗混合液(货号15070063)购自美国Invitrogen Life公司；引物合成自生工生物工程有限公司。

1.4 细胞培养将HL02细胞接种于无菌培养瓶中，加入含10% FBS的RPMI 1640培养液，将其置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

1.5 方法

1.5.1 MTT法测定细胞活力

1.5.1.1 SIN毒性实验 取对数生长期的HL02细胞，均匀添加进96孔板内，孵育过夜后，分别加入2、4、8、16、32、64、128、256、512 μmol·L-1SIN，24 h后加入10 μL 5 g·L-1MTT。培养4 h后弃去上清液，添加100 μL DMSO，使用酶标仪(570 nm)测量吸光度(OD)值。计算细胞生存率。

1.5.1.2 DBT毒性实验 将HL02细胞孵育过夜后分别加入0.25、1、4、16、32 μmol·L-1DBT孵育24 h。按相同方法计算细胞生存率。

1.5.1.3 SIN保护活性实验 HL02细胞经SIN(4、8、16 μmol·L-1)培养24 h后加入3 μmol·L-1DBT孵育6 h，测定OD值。计算细胞生存率。

1.5.2形态学观察 HL02细胞经过DBT以及SIN处理后，使用倒置显微镜(×40)观察，拍照。

1.5.3AO/EB染色法 HL02细胞经过DBT以及SIN处理后，添加1 g·L-1AO和EB溶液，暗处孵育15 min，用冷的PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察后拍照。

1.5.4Annexin V-FITC/PI双染法 使用DBT及不同浓度的SIN处理HL02细胞，收集细胞，避光染色。检测细胞凋亡率。

1.5.5ROS含量测定 HL02细胞经DBT及不同浓度的SIN处理后，加入到10 μmol·L-1DCFH-DA溶液中，37 ℃孵育半小时，反复清洗3次后检测荧光强度。结果用实验组与对照组的平均荧光强度表示。

1.5.6线粒体膜电位检测 将JC-1、超纯水和染色缓冲液按1 ∶160 ∶40比例配置工作液。取1 mL工作液加入处理后的HL02细胞样品中，37 ℃孵育20 min，PBS清洗重悬，检测荧光强度。

1.5.7实时荧光定量PCR 处理后的HL02细胞提取总RNA，并使用酶标仪测量RNA浓度和纯度。之后，按照反转录试剂盒的程序获得到cDNA。基因的相对含量表示为2-ΔΔCt。引物序列如Tab 1所示，内参基因是GAPDH。

1.5.8蛋白印记 收集处理后的HL02细胞，加入裂解液，12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，定量，等量等体积蛋白加到上样孔中进行电泳分离。随后用5%脱脂牛奶封闭1.5 h，一抗在4℃孵育12 h后，二抗室温培养1 h，显影，曝光。

Tab 1 Primer sequence

2 结果

2.1 SIN对DBT诱导HL02细胞毒性的保护效果结果如Fig 1所示，HL02细胞在不同浓度的SIN(2～512 μmol·L-1)中培养12 h后，浓度低于128 μmol·L-1的SIN未对HL02细胞的增殖显示抑制效果。经过DBT单独处理，细胞活力呈浓度依赖性降低，IC50值为2.96 μmol·L-1。相比对照组，DBT处理组的细胞存活率明显下降，而使用SIN预处理可以显著提升细胞存活率，差异有统计学意义(P<0.01)。形态学观察结果显示，DBT处理组HL02细胞变小呈圆珠状，而不同浓度SIN预处理后形态改变的细胞逐渐减少。

2.2 SIN对DBT诱导HL02细胞凋亡的影响结果如Fig 2所示，HL02细胞经DBT处理后核染色质为桔红色并呈固缩状，而不同浓度SIN的预处理后，上述现象逐渐减少。模型组中细胞凋亡率为(25.37±0.87)%，而不同浓度SIN预处理后，细胞凋亡率分别降为对照组(22.30±0.50)%、(18.30±1.04)%、(13.07±1.82)%，与单独使用DBT处理相比较，SIN组凋亡率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 SIN对DBT诱导HL02细胞内ROS含量及MMP的影响实验结果显示(Fig 3)，模型组中细胞内ROS为对照组的(1.99±0.07)倍，而经过不同浓度SIN预处理后，细胞内ROS含量降低至对照组的(1.75±0.04)、(1.46±0.04)、(1.25±0.04)倍。同时，单独使用DBT处理降低MMP至对照组的(0.41±0.04)倍。而经不同浓度的SIN预处理后加入DBT，电位差明显发生改变，分别增长为对照组的(0.54±0.03)、(0.71±0.05)、(0.83±0.04)倍。

2.4 SIN对凋亡相关基因表达的影响采用qRT-PCR技术检测Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cytochome c、

Fig 1 The protective effect of SIN on DBT-induced cytotoxicity of HL02 A：Toxicity of SIN on HL02 cells；B：Toxicity of DBT on HL02 cells；C：The protective effect of SIN on the decline of HL02 cell viability induced by DBT；D：Cell morphology observation results.#P<0.05，##P<0.01 vs control；**P<0.01 vs model.

Fig 2 SIN reduced increase of DBT-induced HL02 cell A：The characteristics of cell apoptosis observed by AO/EB fluorescence staining；B：Cell apoptosis rate detected by Annexin V-FITC/PI double staining；C：The corresponding quantitative data of B.##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.

Apaf-1、caspase-9和caspase-3 的mRNA表达水平。结果显示(Fig 4)，DBT能明显增加Bad、Bax、cytochome-c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA水平、降低Bcl-xL和Bcl-2的mRNA水平。而不同浓度SIN的预处理能明显逆转上述结果，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.5 SIN对凋亡相关蛋白的影响结果如Fig 5所示，经过DBT单独处理，HL02细胞中的Bcl-2/Bax比例明显降低。相比之下，SIN的预处理后二者比例随SIN浓度的提高而升高(P<0.01)。同时，caspase-9与cleaved-caspase-3的表达也降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

自三取代有机锡化合物因高毒性被禁止使用以来，二取代有机锡化合物逐渐发展。其中，二氯二丁基锡的应用十分广泛。本课题组对有机锡类化合物的药理和毒理研究过程中发现：二氯二丁基锡对肝细胞表现出明显的毒性。该毒性可能源于自由基引起的氧化损伤。在对DBT诱导肝细胞毒性的治疗过程中，我们检测了多种中药活性成分，从中筛选发现青藤碱具有一定的保护活性。近期有研究表明，青藤碱可以通过抑制氧化应激，凋亡和炎症发挥肝保护作用[8]。

氧化应激是肝细胞损伤重要的机制之一[9]。过量的ROS可与生物大分子发生反应，使之失活，最终导致细胞损伤。有研究表明，三苯基锡(TPT)可以诱导HepG2肝细胞产生过量ROS，诱导DNA损伤(DNA断裂)，产生细胞毒性[10]。然而，据文献报道青藤碱具有抗氧化应激活性。例如：近期Fang等[8]报道，青藤碱可以通过抑制氧化应激，凋亡和炎症等机制，对乙醇诱导的小鼠肝损伤发挥保护作用；Fan等[11]报道，青藤碱可通过激活PC12细胞的内源性抗氧化机制减轻H2O2导致的细胞毒性。因此，我们推测青藤碱可能通过激活肝HL02细胞内源性抗氧化机制，清除细胞内产生的过量ROS，从而保护线粒体，降低肝细胞凋亡率。本实验结果也证实了DBT诱导的HL02细胞内ROS的过量产生能够经过SIN的预处理得到减轻。

Fig 3 SIN reduced DBT-induced ROS production and MMP depolarization in HL02 (A，C)The result of intracellular ROS and MMP measured by flow cytometry.(B，D)The corresponding quantitative data of(A，C).##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.

在凋亡发生的初期，细胞内过量ROS可以降低抗凋亡蛋白表达、上调促凋亡的蛋白表达。这引起MMP下降与线粒体膜通透性增强[12]。进而导致细胞质中cytochrome-c蛋白增多。其可以和Apaf-1聚合为凋亡体[13]。凋亡体可以激活caspase-9形成cleaved-caspase-9。cleaved-caspase-9进一步诱导下游的caspase-3活化形成cleaved-caspase-3并最终可导致细胞程序性死亡。有研究表明，一些mRNA的表达水平能够反映相应蛋白质的表达水平[14]。本实验结果表明，DBT处理组中Bcl-2和 Bcl-xL的mRNA表达降低，而Bax、Bad、cytochrome c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA表达升高。经过不同浓度SIN的预处理，上述结果发生逆转。Western blot结果也证实SIN能够显著提升Bcl-2与Bax的比值、降低caspase-9与cleaved-caspase-3的表达。

综上所述，本研究结果表明，SIN能够有效降低DBT诱导的HL02细胞损伤，其机制与抑制ROS介导的线粒体凋亡有关。

Fig 4 The mRNA expression of apoptosis-related ##P<0.01 vs control；**P<0.01 vs model.

Fig 5 Expression of apoptosis-related (A，B)The expression of Bcl-2，Bax，caspase-9 and cleaved-caspase-3 proteins.(C，D)The corresponding quantitative data of(A，B).##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.