王翠翠，毕启瑞，张建青，杨 琳，姚 帅，果德安*

一测多评法定量分析半夏及其混伪品中的4种核苷类成分

王翠翠1, 2，毕启瑞2，张建青2，杨 琳2，姚 帅2，果德安1, 2*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 中国科学院上海药物研究所，中药标准化技术国家工程研究中心，上海 201203

建立一测多评法测定半夏及其混伪品天南星、水半夏和虎掌南星中尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷的含量方法。利用高效液相色谱法，采用Shim-pack Scepter C18-120色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相10%乙腈-水，梯度洗脱；体积流量1 mL/min；检测波长260 nm；柱温20 ℃。以腺苷为内标，建立尿苷、腺嘌呤和鸟苷的相对校正因子，同时采用外标法和一测多评法测定多批次药材中4种成分的含量，验证一测多评法的准确性和可行性。尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷在各自线性范围内线性关系良好（＞0.999 9），平均加样回收率95.40%～104.02%，一测多评法和外标法测得的含量无显著差异（RSD＜3%），不同产地的半夏中4种核苷含量显示有明显差异。除天南星外，基于核苷的含量测定结果结合化学计量分析可以很好地区分半夏、水半夏和虎掌南星。该方法简便准确度高，可为半夏的质量控制和评价提供参考。

一测多评；半夏；天南星；水半夏；虎杖南星；混伪品；核苷；化学计量分析

半夏是天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥块茎，有毒，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效[1]。有报道表明核苷类成分为半夏降逆止呕的主要药效物质[2]，核苷类成分药理作用广泛，不仅是许多物质的代谢前体，而且在细胞生理学中也发挥多重作用[3]。现阶段半夏的检测与定量多集中于生物碱、有机酸和核苷类成分，关于半夏混伪品的含量测定报道较少，且上述含量测定多采用外标法[2,4-5]，鲜有一测多评法用于半夏中核苷类成分的测定。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by a single marker ，QAMS）在被《中国药典》2010年版收录，并在美国药典和欧盟药典的中草药标准中得到广泛应用，大量文献研究报道了一测多评法的验证及其在中药分析和标准中的应用[6-9]。本实验采用高效液相色谱法，建立了一测多评法测定半夏、天南星、水半夏和虎掌南星中尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷4种核苷类成分的含量，为半夏的质量控制和评价提供了参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪（Agilent G7111B四元泵，Agilent G7129A进样器，Agilent G7115A DAD检测器）；P180H型超声波水浴锅（德国埃尔玛公司）；A-14型离心机（赛多利斯北京有限公司）；Secura 125-1CN型电子天平（赛多利斯北京有限公司）；Quintix 224-1CN型电子天平（赛多利斯北京有限公司）；Milli-Q Integral型超纯水系统（Millipore，Bedford公司，美国）。

1.2 试剂与药材

对照品尿苷（批号8041，质量分数97.2%）、腺嘌呤（批号5815，质量分数99.6%）、鸟苷（批号3877，质量分数≥98.0%）、腺苷（批号5747，质量分数99.3%）均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司，半夏对照药材（批号121272-201806）购于中国食品药品检定研究院。乙腈（质谱级，Honeywell，批号UCCAIH），超纯水。

11批半夏、5批水半夏、5批虎掌南星、3批天南星均来源于市售及饮片生产厂家（表1），并经上海药物研究所中药标准化技术国家工程研究中心姚帅高级实验师鉴定为天南星科半夏属植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥块茎，天南星为天南星科植物天南星(Wall.) Schott的干燥块茎，水半夏为天南星科犁头尖属植物鞭檐犁头尖(Lodd.) Blume.的干燥块茎，虎掌南星为天南星科植物虎掌Schott的干燥块茎。

表1 样品信息

Table 1 Information of samples

样品名称样品编号产地收集时间生产厂家 半夏湖北湖北2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏河南1河南2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏河南2河南2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏河南3河南2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏河南4河南2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏山东1山东2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏山东2山东2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏山东3山东2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏山东4山东2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏山东5山东2020-07伊春五加参药业有限责任公司 半夏河北河北2021-11市售 虎掌南星虎掌1安徽2021-11市售 虎掌南星虎掌2安徽2021-11市售 虎掌南星虎掌3河北2021-11市售 虎掌南星虎掌4贵州2021-11市售 虎掌南星虎掌5云南2021-11市售 水半夏水半夏1四川2021-11市售 水半夏水半夏2甘肃2021-11市售 水半夏水半夏3甘肃2021-11市售 水半夏水半夏4四川2021-12市售 水半夏水半夏5江西2021-12市售 天南星天南星1河北2021-11市售 天南星天南星2河北2021-11市售 天南星天南星3湖北2021-12市售

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Shim-pack Scepter C18-120色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水（A）-10%乙腈（B），梯度洗脱：0～10 min，83%～80% A，10～20 min，80%～40% A；20～30 min，40%～0 A；体积流量1 mL/min；检测波长260 nm；柱温20 ℃；进样量20 μL。混合对照品和半夏样品的高效液相色谱图（HPLC）如图1所示。

1-尿苷 2-腺嘌呤 3-鸟苷 4-腺苷

2.2 混合对照品溶液的制备

取尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷对照品适量，精密称定，加水制成含尿苷11.01 μg/mL、腺嘌呤7.86 μg/mL、鸟苷17.86 μg/mL、腺苷11.78 μg/mL的混合对照品储备液，4 ℃冰箱保存备用。

2.3 供试品溶液的制备

取半夏粉末（过4号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 mL，称定质量，超声处理（功率1130 W、频率37 kHz）30 min，冷却至室温，再称定质量，用纯水补足减失的质量，摇匀后12 000 r/min离心10 min，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 分别精密吸取尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷对照品溶液及混合对照品溶液、半夏对照药材溶液和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。色谱峰的先后顺序为尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷，单一对照品溶液、混合对照品溶液、半夏对照药材溶液和供试品溶液的保留时间和最大紫外吸收波长一致，表明方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品储备液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于5 mL量瓶中，加水定容至刻度，混匀。分别精密吸取上述系列溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样分析。以4种对照品的质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（），4个成分在相应的质量浓度范围内线性关系良好，结果见表2。

表2 4个分析物的回归方程、线性范围、相关系数

Table 2 Regression equation, linear range and correlation coefficient of four compositions

成分回归方程r线性范围/(μg·mL−1) 尿苷Y＝46.385 X＋0.407 80.999 92 0.44～11.01 腺嘌呤Y＝109.71 X＋0.170 60.999 920.31～7.86 鸟苷Y＝43.288 X＋1.303 80.999 92 0.71～17.86 腺苷Y＝63.329 X＋1.002 90.999 92 0.47～11.78

2.4.3 仪器精密度试验 精密吸取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定5次，测得尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷峰面积RSD分别为0.11%、0.08%、0.04%、0.10%。

2.4.4 中间精密度试验 在不同日期、由不同人员分别取同一批样品（河南1）3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，使用不同的3台高效液相色谱仪测定含量，3次实验测得尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量的RSD分别为0.85%、1.53%、0.71%、0.66%。

2.4.5 重复性试验 取同一批样品（河南1）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测得尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷含量的RSD分别为0.81%、0.54%、0.50%、0.52%。

2.4.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液和对照品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h按“2.1”项下色谱条件进样分析，测得供试品溶液中尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷的峰面积RSD分别为2.52%、2.95%、1.67%、1.37%，保留时间RSD分别为0.42%、0.30%、0.32%、0.30%；对照品溶液中尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷的峰面积RSD分别为0.15%、0.20%、0.17%、0.24%，保留时间RSD分别为0.44%、0.24%、0.23%、0.08%。

2.4.7 加样回收率试验 精密称取已测定的半夏药材粉末9份，每份0.5 g，分别加入低、中、高浓度对照品溶液（低、中、高浓度对照品加入量与所取供试品中待测成分含量之比分别为0.5∶1、1∶1、1.5∶1），制备低、中、高3种浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备3份样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算回收率，尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷的加样回收率分别为98.50%、104.02%、101.38%、95.40%，RSD值分别为0.79%、1.39%、1.71%、3.29%。

2.4.8 耐用性考察 考察了不同色谱柱（Shim-pack GIST C18-AQ、Shim-pack Scepter C18-120）、流动相初始比例（16%、17%、18%）、体积流量（1.1、0.9、1.0 mL/min）和检测波长（263、257、260 nm）对该方法的影响，测得4种成分的含量的RSD为0.02%～3.18%，表明方法耐用性良好。

2.5 相对校正因子计算

本实验采用斜率法[7]，以腺苷为内参物。计算公式为f/s=a/s，式中为相对校正因子，s为内参成分斜率，a为待测成分斜率。按“2.4.2”项下方法制备3条标准曲线，4种核苷的3条标准曲线的均大于0.999 8，再计算斜率得到相对校正因子，结果见表3。

表3 半夏中尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷的相对校正因子

Table 3 Conversion factors of uridine, adenine, guanosine, and adenosine in Pinelliae Rhizoma

标准曲线f尿苷/腺苷f腺嘌呤/腺苷f鸟苷/腺苷 标曲11.3720.5791.461 标曲21.3650.5771.463 标曲31.3950.5661.463 均值1.3800.5701.460 RSD/%1.1301.2800.080

2.6 相对校正因子重复性考察

考察了3台高效液相色谱仪和2种不同色谱柱对校正因子的影响，结果显示尿苷、腺嘌呤、鸟苷对腺苷的相对校正因子和相对保留时间RSD均小于1.0%，表明使用不同仪器及色谱柱均具有良好的重现性，结果见表4。

表4 不同色谱仪和色谱柱的相对校正因子和相对保留时间

Table 4 Conversion factors and relative retention times at different instruments and different columns

仪器/色谱柱f尿苷/腺苷f腺嘌呤/腺苷f鸟苷/腺苷tR尿苷/腺苷tR腺嘌呤/腺苷tR鸟苷/腺苷 Agilent 1260 Infinity II1.3720.5791.4610.3730.6570.732 Agilent 1260 Infinity1.3790.5831.4630.3720.6580.732 Agilent 1260 Infinity II1.3840.5841.4520.3650.6510.725 RSD/%0.8500.1500.8500.1600.2500.270 Shim-pack GIST C18-AQ1.3730.5781.4760.3780.6820.728 Shim-pack Scepter C18-1201.3690.5751.4600.3780.6820.728 RSD/%0.2000.3100.7400.0000.0000.000

2.7 一测多评法与外标法多批次样品测定结果比较

取不同批次半夏、天南星、水半夏和虎掌南星，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，每种样品平行制备2份，计算平均含量。按“2.1”项下色谱条件分别采用外标法、一测多评法测定含量，见表5。结果2种方法测定结果无显著差异，表明一测多评法具有较高可信度。

2.8 化学计量学分析

本实验用半夏及其混伪品的多批次样品建立化学计量分析的共有模式，4个核苷类成分作为化学计量学分析的变量，统计汇总24批药材中4种核苷的含量，使用SIMCA 14.0和Origin 2022软件进行主成分分析和分层聚类热图分析。

结果如图2所示，结果表明，水半夏、虎掌南星和半夏、天南星可以较好地区分，半夏与天南星的区分较差，其中半夏的聚类可根据产地大致分为2类，左上角5批半夏的产地均为中部地区，右下角6批半夏的产地均为东部地区。水半夏含有的4种核苷总量较少，为0.081～0.176 mg/g，虎掌南星的总质量分数为0.507～0.905 mg/g，在4种药材中总核苷质量分数最多，这与夏成凯等[10]的研究结果一致，半夏和天南星的核苷总量分别为0.428～0.561 mg/g和0.377～0.493 mg/g。分层聚类热图可将水半夏、虎掌南星、中部地区半夏、天南星和东部地区半夏很好地聚成5类，与主成分分析结果一致，其中虎掌南星的腺苷含量较少，水半夏整体核量较少，中部半夏腺苷和鸟苷含量较高，天南星和东部半夏鸟苷含量较高。

表5 半夏、天南星、水半夏和虎掌南星中4种成分的含量测定结果（n＝2）

Table 5 Contents of four components in Pinelliae Rhizoma, Arisaematis Rhizoma, tubers of T. flagelliforme and P. pedatisecta by external standard methods and QAMS (n＝2)

样品名称尿苷/(mg·g−1)腺嘌呤/(mg·g−1)鸟苷/(mg·g−1)腺苷/(mg·g−1) 外标法QAMSRSD/%外标法QAMSRSD/%外标法QAMSRSD/%外标法 河南10.1190.1200.790.0810.0792.120.1800.1761.480.121 河南20.0780.0790.790.0720.0702.120.1680.1651.480.123 河南30.0880.0890.790.0850.0832.120.1830.1801.480.116 河南40.0790.0800.790.0680.0662.120.1560.1531.480.129 湖北0.0860.0870.790.0820.0802.120.1660.1621.480.109 河北0.1390.1410.790.1110.1082.120.1880.1841.480.061 山东10.1620.1640.790.1060.1032.120.1930.1891.480.051 山东20.1860.1880.790.1140.1102.120.2110.2071.480.056 山东30.1670.1690.790.1020.0992.120.1990.1951.480.068 山东40.1650.1670.790.0990.0962.120.1920.1881.480.062 山东50.1780.1800.790.1010.0982.120.1790.1761.480.063 天南星10.1080.1090.790.0940.0912.120.1300.1281.480.049 天南星20.1700.1720.790.1060.1032.120.1560.1531.480.065 天南星30.1070.1080.790.0930.0912.120.1490.1461.480.076 虎掌10.2650.2680.790.1190.1162.120.1840.1811.480.027 虎掌20.2820.2860.790.1210.1172.120.1750.1721.480.024 虎掌30.4520.4570.790.1180.1152.120.1580.1551.480.026 虎掌40.5080.5140.790.1660.1612.120.2210.2171.480.013 虎掌50.3170.3200.790.0910.0892.120.0930.0911.480.008 水半夏10.0540.0540.790.0410.0402.120.0210.0201.480.033 水半夏20.0470.0480.790.0270.0262.120.0000.0000.000.008 水半夏30.0580.0580.790.0590.0572.120.0290.0281.480.033 水半夏40.0280.0290.790.0360.0352.120.0120.0121.480.006 水半夏50.0340.0340.790.0320.0322.120.0100.0101.480.028

3 讨论

本实验通过单因素实验考察了提取溶剂（水、20%甲醇、50%甲醇、甲醇）、提取方式（超声、回流）、超声时间（15、30、45、60 min）、提取体积（10、25、50 mL）和提取次数（1、2次），综合考虑提取效率和操作的简便性，最终选择25 mL水超声30 min。

考察了不同色谱柱（Waters Atlantis T3、Kromasil Eternity XT-5-C18、Shim-pack GIST C18-AQ、Shim-pack Scepter C18-120）和流动相（乙腈-水、甲醇-水、10%乙腈-水、10%乙腈-0.1%甲酸水、10%乙腈-0.1%磷酸水），综合考虑理论塔板数、分离度和拖尾因子，最终选择Shim-pack Scepter C18-120色谱柱及10%乙腈-水。乙腈的峰形优于甲醇，同时考虑到方法在其他仪器上的重现性，故选择10%乙腈作为流动相。因尿苷和腺苷的最大吸收波长为260 nm，鸟苷和腺嘌呤的最大吸收波长分别为252 nm和262 nm，故选择260 nm的检测波长。

在建立腺苷与其余3种成分间的相对校正因子的评价中，本实验考察了不同色谱柱、不同仪器，结果表明一测多评法与外标法测得的含量值之间没有显著性差异，表明建立的校正因子具有较好的可信度。根据内标峰的保留时间、相对保留时间和最大紫外吸收波长，能够准确判断目标峰的位置，结果表明，利用上述方法进行峰的定位可行。

图2 半夏及其混伪品的4种核苷含量主成分分析图(A)、HPLC图(B) 和4种核苷含量分层聚类热图(C)

主成分分析结果表明，水半夏聚落较为紧凑，而半夏、天南星和虎掌南星的聚落较为分散，整体离散度较大，这可能与其产地不同有关，不同土壤及气候对药材中核苷的含量影响较大。11批半夏的尿苷质量分数为0.079～0.188 mg/g，腺嘌呤质量分数为0.066～0.110 mg/g，鸟苷质量分数为0.153～0.207 mg/g，腺苷质量分数为0.051～0.129 mg/g，在张勇等[11]测得的12批半夏中相应的4种核苷含量范围内，与王朋展等[12]测定的7批半夏的腺嘌呤、鸟苷和腺苷含量范围一致。3批天南星的4种核苷含量与夏成凯等[10]测定的1批天南星相比，后者尿苷含量低于本实验测得范围，腺苷含量在本实验范围内，没有检测到鸟苷，王朋展等[12]测定的1批天南星没有检测到腺苷，测得的腺嘌呤、鸟苷和尿苷的含量均高于本实验所测；5批水半夏测得的4种核苷含量均低于王朋展等[12]和夏成凯等[10]测定的1批水半夏；王朋展等[12]测定了3批虎掌南星，夏成凯等[10]测定了1批虎掌，尿苷、腺嘌呤和鸟苷的含量均在本实验测定的5批虎掌南星的范围内，但腺苷含量均高于本实验，而甄子萱等[13]测得的4批掌叶半夏的腺苷含量在本实验范围内。导致上述差异的原因可能为产地不同，同时样品批次过少，测定结果有待多批次验证。

随着市场需求的增加、野生资源的减少及栽培技术的落后[14-15]，市场流通中混有大批半夏同科近缘品种[10, 12]。半夏及其3个混伪品天南星、水半夏和虎掌南星的传统鉴定方法主要包括性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱、指纹图谱、红外光谱和DNA条形码[16-19]，本实验通过主成分分析和分层聚类热图分析，依据4种核苷含量可以很好地区分半夏、水半夏和虎掌南星，但不能鉴别天南星和半夏。同时半夏产地较广，不同产地对核苷含量影响较大，样本量越大化学计量分析结果可信度越高，本研究的实验结果有待进一步广泛收集样本进行验证。综上，本实验建立的一测多评法在测定半夏中的尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量时具有较高的重现性、稳定性和可靠度，并能应用到半夏混伪品水半夏、天南星和虎掌南星的区分，为半夏的质量控制提供参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quantitative analysis of four nucleosides inand its adulterants by the quantitative analysis of multi-components by a single marker

WANG Cui-cui1, 2, BI Qi-rui2, ZHANG Jian-qing2, YANG Lin2, YAO Shuai2, GUO De-an1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. National Engineering Research Center of TCM Standardization Technology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

To establish a method for the determination of uridine, adenine, guanosine and adenosine inand its adulterants, including, tubers ofandby quantitative analysis of multi-components by a single marker (QAMS).The nucleosides were analyzed in Shim-pack Scepter C18- 120 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) by high performance liquid chromatography (HPLC); The gradient elution was carried out with the mobile phase composed of 10% acetonitrile-water at the flow rate of 1 mL/min and the detection wavelength of 260 nm, column temperature at 20 ℃. Adenosine was used as the internal reference substances to establish the conversion factors of uridine, adenine and guanosine. At the same time, the contents of multiple batches of medicinal materials were determined by external standard method and QAMS to verify the accuracy and feasibility of QAMS.The results showed that uridine, adenine, guanosine and adenosine had good linear relationship in the ranges of the tested concentrations (＞0.999 9), and the average recoveries were 95.40%-104.02%. There was no significant difference in the contents of uridine, adenine, guanosine and adenosine measured by QAMS and external standard method (RSD＜3%). The contents of four kinds of nucleosides infrom different habitats showed significant variations. Except for,, tubers ofandcould be distinguished by the content of nucleoside combined with chemometrics. Conclusion The method has high accuracy and simple, which can provide a reference for the quality evaluation and control of.

single standard to determine multi-components;(Thunb.) Breit.;(Wall.) Schott;(Lodd.) Blume.;Schott; adulterants; nucleosides; chemometrics

R286.2

A

0253 - 2670(2022)19 - 6180 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.024

2022-03-09

国家自然科学基金重点项目（82130111）；国家自然科学基金青年项目（82003940）

王翠翠（1998—），女，硕士研究生，研究方向为中药质量标准研究。Tel: 18337682088 E-mail: 20190392@njucm.edu.cn

果德安，研究员，博士生导师，主要从事中药化学与现代质量标准研究。Tel: (021)50271516 E-mail: daguo@simm.ac.cn

[责任编辑 时圣明]