刘亭亭, 汪汉成, 蔡刘体, 孙美丽,陆 宁, 向立刚, 张长青

(1. 长江大学农学院, 荆州 434000; 2. 贵州省烟草科学研究院, 贵阳 550081)

烟草赤星病(tobacco brown spot)是烟叶成熟期的主要真菌性病害,其病原菌为半知菌亚门Deuteromycotina链格孢属Alternaria真菌,该属病原菌寄主范围广,烟草、棉花、柑橘等均可被其侵染[1-3]。目前已知可引起烟草赤星病的链格孢种类有链格孢A.alternata、长柄链格孢A.longipes、极细链格孢A.tenuissima、鸭梨链格孢A.yaliinficiens和A.tabacicola[4],其中又以A.alternata最为严重和普遍,所以本研究以该种作为研究对象。烟草赤星病的发生与流行受多种因素影响,其中温度是病原菌生长、侵染和致病过程中的重要环境影响因子[5-7]。有研究发现烟草赤星病发生的最适温度范围为23.7～28.5℃[8],A.alternata菌丝生长和产孢最适温度在21～28℃,但不同温度下生长速率和产孢量有较大差异[9]。除生物学特性外,温度也可影响病原菌致病力,如刘畅等[10]研究发现,黑胫病菌Phytophthoranicotianae可致病温度范围为21～35℃,其中30、35℃时致病力最强。汪汉成等[11]研究发现,烟草青枯病菌Ralstoniasolanacearum可致病的温度范围为25～35℃,30～35℃时致病力最强。

除了温度外,影响病原菌侵染与危害的其他生态环境因子还包括碳源营养等。汪汉成等[12]的研究发现,烟草赤星病菌能高效代谢包括L-果胶糖、D-半乳糖、D-甘露糖等在内的34种碳源。病原菌在不同渗透压和pH环境下的代谢表型特征能够反映其对环境的耐受力,如刘畅等[10]进行不同温度、不同渗透压/pH下烟草黑胫病菌的代谢表型研究时发现,27℃和30℃时烟草黑胫病菌的渗透压适应范围最广,20、27℃和30℃时,烟草黑胫病菌在pH 5.0～10.0范围内可正常代谢。Wang等[13]发现,在30℃和35℃时,烟草青枯病菌对渗透压和pH的适应性较强。然而,作为危害烟叶生产最严重病原菌之一的赤星病菌,其在不同温度下对不同碳源、渗透压和pH的适应能力却缺乏了解。

为此,本研究采用菌丝生长速率法和离体叶片法分别测定了不同温度下烟草赤星病菌的生长速率和致病力,并采用Biolog代谢表型技术测定了在22、25、30℃和35℃下不同碳源、渗透压和pH对其代谢表型特征的影响,旨在通过代谢表型了解温度对烟草赤星病菌致病力的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Biolog PM9和PM10代谢板(货号:12161、12162),Biolog FF代谢板(货号:94545),FF-IF接种液(filamentous fungi-inoculating fluid)(货号:72106):由0.03%吐温40和0.25%吉冷胶制成,Omnilog PM高通量微生物细胞表型芯片测定系统(货号:91171),均购自美国Biolog公司。3种代谢板分别用于测定病原菌在不同渗透压、pH和碳源下的代谢表型。D-葡萄糖(货号:G5400),购自美国Sigma公司;酵母氮源(货号:239210),购自美国Difco公司。

1.2 方法

1.2.1不同温度对烟草赤星病菌生物学特性的影响

1.2.1.1烟草赤星病菌生长速率测定

采用菌丝生长速率法[14]测定不同温度下菌丝生长速率。用直径6 mm打孔器打取30℃黑暗培养5 d的赤星病菌菌碟,分别置于PDA培养基上，15、20、25、30、35、40℃黑暗条件下培养,每个处理3组重复,分别于接种后3、5、7 d采用“十字交叉法”测量菌落直径,并计算生长速率。

1.2.1.2烟草赤星病菌产孢量测定

将病原菌接种到PDA培养基上,分别置于15、20、25、30、35、40℃的生化培养箱中黑暗培养,每个处理3组重复,培养7 d后用10 mL无菌水洗涤平板,制成孢子悬浮液,在显微镜下利用血球计数板测定单位面积(cm2)的产孢量[15]。

1.2.1.3烟草赤星病菌孢子萌发率测定

将病原菌在AEA培养基上30℃黑暗培养7 d后,用无菌水将分生孢子洗下,双层纱布过滤得到孢子悬浮液,调节孢子浓度至1×105个/mL。采用凹玻片法[16]测定病原菌孢子萌发率,将制备好的玻片分别置于15、20、25、30、35、40℃条件下恒温保湿黑暗培养,12 h后在显微镜下观察孢子萌发情况,以芽管长度大于孢子短半径视为萌发,记录各处理孢子萌发情况。

观察组治疗有效率为92.00%，对照组为68.00%。与对照组相比，观察组的治疗有效率更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。详细见（表1）。

1.2.1.4烟草赤星病菌致病力测定

病原菌在PDA培养基上30℃黑暗培养5 d后用直径6 mm的打孔器在菌落边缘打取菌碟。采集‘云烟87’烟株中下部健康叶片,无菌水冲洗,再用75%乙醇对烟叶表面消毒,无菌水冲洗后晾干。每片烟叶以叶脉为分界,用接种针在对称烟叶叶肉部位刺伤接种4个菌碟[17],然后分别置于15、20、25、30、35、40℃光照培养箱(L∥D=12 h∥12 h, RH 70%,光照强度:6 000 lx)培养,每处理接种3片烟叶。分别于培养24、48、72、120 h时采用十字交叉法测量病斑直径。

1.2.2不同温度下不同碳源对烟草赤星病菌代谢表型的影响

采用Biolog公司的FF代谢板进行烟草赤星病菌碳源代谢表型分析[18]。将烟草赤星病菌接种到AEA培养基上于25℃、黑暗下培养5 d,至产生大量分生孢子,用无菌棉签蘸取孢子,用FF-IF接种液制备孢子悬浮液,调整孢子悬浮液的浓度为1×105个/mL,然后依次加入FF代谢板微孔中(100 μL/孔)。接种完毕后的代谢板置于恒温培养箱中,分别于22、25、30℃和35℃下培养7 d。在OmniLog工作软件中设置培养孢子悬浮液所需温度和时间,然后采用Biolog D5E_OKA_data.exe软件收集赤星病菌在生长过程中代谢板孔内的颜色变化值,根据微生物代谢的孔颜色变化值,使用Excel 2019制作热图,分析其碳源代谢表型。

1.2.3不同温度下不同渗透压和pH对烟草赤星病菌代谢表型的影响

取20.05 mL 1.2.2中的孢子悬浮液与0.75 mLD-葡萄糖溶液、2 mL酵母氮源溶液和1.2 mL无菌水混合均匀,将混合液加入PM9和PM10代谢板，分别测定病原菌在不同渗透压和pH下的代谢表型。将接菌后的PM9、PM10代谢板分别于22、25、30℃和35℃恒温培养箱中培养7 d。代谢表型的分析方法同1.2.2。

1.3 数据分析

使用SPSS 24.0软件对试验数据进行单因素方差分析,应用LSD(least significant difference)法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同温度对烟草赤星病菌生物学特性的影响

温度对烟草赤星病菌菌丝生长、产孢量、孢子萌发和致病力均有影响,且不同温度下各参数间存在显著差异(表1)。15～35℃时病原菌菌丝均可生长产孢,孢子均可萌发;40℃时菌丝停止生长、产孢,孢子不萌发;菌丝最适生长与产孢温度为30℃,孢子最适萌发温度为35℃。当温度为15℃和40℃时,接种叶片不发病;温度30℃时病斑直径最大,为最适致病温度。

表1 不同温度对烟草赤星病菌生物学特性的影响1)

2.2 不同温度下碳源对烟草赤星病菌代谢表型的影响

在22、25、30℃和35℃下,烟草赤星病菌代谢的碳源种类和代谢强度存在着共性与差异(图1)。4个测试温度下,烟草赤星病菌对所有供试碳源均可正常代谢,其所代谢的碳源种类随温度升高而增多。在22、25、30℃和35℃时,烟草赤星病菌可高效代谢的碳源分别有44、46、48种和54种,烟草赤星病菌代谢弱的碳源分别有1、2、5种和4种。

图1 烟草赤星病菌在FF代谢板上的代谢特征Fig.1 Metabolic features of the pathogen Alternaria alternata in Biolog Phenotype MicroArray FF plates

2.3 不同温度下渗透压和pH对烟草赤星病菌代谢表型的影响

2.3.1不同温度下渗透压对烟草赤星病菌代谢表型的影响

在22、25、30℃和35℃时,烟草赤星病菌能进行高效代谢的渗透压环境分别有76、71、56种和2种,烟草赤星病菌代谢弱的渗透压环境分别有9、11、14种和18种。4个温度下,烟草赤星病菌在20～200 mmol/L苯甲酸钠(pH 5.2)和40～100 mmol/L亚硝酸钠渗透压环境下均代谢弱或不能代谢。在35℃时,烟草赤星病菌在100 mmol/L硫酸铵(pH 8.0)、100 mmol/L亚硝酸钠条件下完全不能代谢(图2)。

2.3.2不同温度下pH对烟草赤星病菌代谢表型的影响

4个测试温度下烟草赤星病菌可进行代谢的pH范围均为3.5～10,但在不同温度和pH环境下代谢表型存在差异。在pH 4.5,烟草赤星病菌在22、25℃及30℃下均可高效代谢大多数测试氨基酸;而在35℃下,烟草赤星病菌仅可高效代谢精氨酸(arginine)、天冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)等10种氨基酸。在pH 9.5,烟草赤星病菌在22℃和35℃下对测试氨基酸的代谢相对较弱;而在25℃和30℃下,其可高效代谢的氨基酸种类分别为6种和2种。此外,在22、25℃及30℃下,烟草赤星病菌表现出较强的脱羧酶活性和较弱的脱氨酶活性;在35℃下,其脱羧酶和脱氨酶活性相对较弱。在H01～H12微孔中,烟草赤星病菌在25℃和30℃时对所有测试化合物均可高效代谢,22℃时可高效代谢的化合物数量相对较少,而35℃时可高效代谢的仅有辛酸盐(caprylate)、X-β-D-葡糖苷酸(X-β-D-glucuronide)、X-β-D-氨基葡萄糖苷(X-β-D-glucosaminide)及X-β-D-氨基半乳糖苷(X-β-D-galactosaminide)(图3)。

3 结论与讨论

烟草赤星病是烟叶生产上的重大病害之一,每年都会对烟草行业造成重大经济损失[19]。温度对病原菌的生物学特性具有显著影响,本研究结果显示,烟草赤星病菌15～35℃条件下均可生长,25～30℃适合产孢,这与Dickinson等[20]的研究结果基本一致。本文发现烟草赤星病菌30℃下菌丝生长最快、致病力最强,结果与唐明等[9]报道的28℃为最适菌丝生长温度较为接近;同时,致病力结果与孔凡玉[8]报道的烟草赤星病发病的适宜温度范围为23.7～28.5℃类似,其差异原因可能为试验方法不同,本文采用室内离体叶片法,而后者为田间监测结果。

碳源是植物病原菌生存的基本营养物质,已有研究表明,温度会影响病原菌代谢碳源的种类和强度,如黑胫病菌P.nicotianae[10]、烟草青枯病菌R.solanacearum[13]。李六英等[21]的研究发现,烟草赤星病菌28℃时仅能代谢Biolog PM1-2板中24.21%的碳源;王友升等[22]的研究发现,链格孢26℃时可代谢Biolog FF板中77种碳源物质;汪汉成等[12]的研究发现,烟草赤星病菌25℃时可高效代谢Biolog PM1-2代谢板中的34种碳源。相比而言,本文采用Biolog FF碳源代谢板进行测试,其碳源种类较Biolog PM1-2代谢板少,但大部分碳源为常见真菌可代谢碳源,能反映烟草赤星病菌对大部分碳源的需求。本文发现烟草赤星病菌在22、25、30℃及35℃下均可代谢所有碳源物质,在4个温度下,均能高效代谢N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺、苦杏仁苷等23种碳源,推测这些碳源均为烟草赤星病菌的适宜碳源。烟草赤星病菌代谢碳源的数量随温度升高而增多,推测温度会影响病原菌生理生化途径的变化,进而影响碳源代谢种类的变化,4种温度下烟草赤星病菌利用率均高的碳源是否与烟草赤星病的发生与危害程度有关有待下一步深入研究。

除了营养物质外,温度、渗透压和pH等环境因子也影响病原菌的生物学特性与致病力[23-24]。病原菌在不同环境条件下代谢能力的变化可以反映其对环境的耐受能力[10]。对不同温度、渗透压和pH下青枯菌和黑胫病菌代谢表型研究发现,30～35℃时青枯病菌对渗透压和pH适应能力较强,27～30℃时烟草黑胫病菌对渗透压和pH适应能力较强,该结果与生产上高温时黑胫病和青枯病危害较重相吻合[10-11]。对不同温度、渗透压和pH环境条件下烟草赤星病菌的代谢表型研究发现,温度影响烟草赤星病菌对渗透压和pH环境适应力,25℃和30℃时其适应范围广。其与烟草青枯菌和黑胫病菌对高温的响应规律基本一致,原因可能为青枯病菌、黑胫病菌及赤星病菌的最适发病温度相似。此外,汪汉成等[12]也报道了25℃时不同烟草赤星病菌菌株的渗透压和pH适应范围,本文研究结果与其基本一致,均发现烟草赤星病菌存在强脱羧酶活性和弱脱氨酶活性。本文发现25℃和30℃时,烟草赤星病菌在H01～H12微孔中的pH环境下烟草赤星病菌可高效代谢微孔内的全部物质,而35℃时仅可高效代谢4种,推测温度对烟草赤星病菌的脱羧酶和脱氨酶活性产生了较大影响,其影响机理有待下一步深入研究。

图2 烟草赤星病菌在不同温度和渗透压下的代谢表型Fig.2 Metabolic features of Alternaria alternata at different temperatures and osmotic pressure

图3 烟草赤星病菌在不同温度和pH环境下的代谢表型Fig.3 Metabolic features of Alternaria alternata under different temperatures and different pH values