氟他胺（Flutamide）是一类用于治疗前列腺癌的抗雄性激素药物，在临床上有广泛的应用[1-3]，其作用机理主要为阻断雄性激素对前列腺的作用，从而对前列腺肿瘤进行抑制[4]。同时也有研究表明，氟他胺能有效抑制高雄激素血症[5]，能提高多囊卵巢综合症患者的糖代谢能力和脂代谢能力[6]，改善患者的排卵情况[7]。由于其作用为抑制雄性激素，效果与雌激素相似，在乳制品行业中经常被不法商家用于奶牛饲养[8-9]，以达到促进机体成长和促乳的效果[10-11]。我国目前还没有相关的法律法规规定氟他胺在乳制品中的限量，也没有相关的国标测定方法。

目前，抗激素类药物的检测方法主要有分光光度法[12]、液相色谱法[13-15]和液相色谱串联质谱法[16-20]。分光光度法需要对目标物进行衍生，且难以同时测定代谢物，分析结果受杂质影响大。液相色谱法分离难度大，检测器灵敏度较低，适用于药片或含量较大的样品测定，对于含量较低的样品难以检出，且难以准确定量。液相色谱串联质谱法则具选择性强、分析时间短、定性能力高的优点。本文建立了高分辨飞行时间质谱法测定液态乳中的氟他胺及羟基氟他胺，该方法高效、回收率好、结果偏差小，对乳制品中抗激素药物残留相关检测方法的研究有较大的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氟他胺和羟基氟他胺（＞99.0%，上海安谱公司）；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚（HPLC级，美国赛默飞公司）；C18、PSA、GCB、硅胶、NH2粉、中性氧化铝、无水Mg2SO4、NaCl（分析纯，上海安谱公司）；超纯水。

1.2 仪器与设备

API5600+质谱仪（美国AB SCIEX公司）；LC-20AD液相色谱系统（日本岛津公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水系统（法国Merck Millipore公司）；4k-15离心机（德国Sigma公司）；KQ-800DB超声仪（昆山超声仪器有限公司）；Multi Reax涡旋振荡器（德国Heidolph公司）；Promax 2020摇床（德国Heidolph公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取氟他胺和羟基氟他胺标准品于容量瓶中，乙腈稀释至刻度，得到质量浓度为1 000 mg·L-1的溶液，于-4 ℃保存。

基质曲线：选取阴性样品按照1.3.2的方法处理，得到空白基质液，稀释后得到基质曲线，各级浓度为1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1和100 μg·L-1。

1.3.2 前处理方法

称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL 水，涡旋振摇5～10 s，然后加入10 mL乙酸乙酯，涡旋混匀，加入4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，振摇15 min。以10 000 r·min-1离 心5 min，准 确 移 取1 mL上 清液，40 ℃氮吹至干，加入1 mL乙腈复溶，转移至1.5 mL含有100 mg C18粉末的离心管中，涡旋2 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜上机。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；进样量为5.0 μL；柱温为35 ℃；流动相：流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脱模式：等度洗脱，A∶B=80∶20。

（2）质谱条件。离子源：ESI和APCI复合源，负离子扫描；一级TOF-MS扫描质量范围（m/z）：50～500 Da；二级IDA-MS扫描准确质量范围（m/z）：50～500 Da；每10个样品自动校正1次，负离子模式校正液流速为0.5 mL·min-1；气帘气（N2）：35 psi；离子源雾化气（N2）：45 psi；离子源加热辅助气（N2）：45 psi；离子源温度为450 ℃；离子源电压-4 500 V。去簇电压DP为90 V，碰撞能量CE为（30±15）eV；监测模式：TOF-IDA-MS。

1.3.4 数据分析处理

化合物的碎片信息使用Analyst TF 1.6软件采集，并采用PeakView 2.0、MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等软件进行进一步的处理，获得一级离子和二级碎片离子的质荷比、精确分子质量及其同位素比值等。氟他胺和羟基氟他胺的质谱参数见表1。

表1 氟他胺和羟基氟他胺的碎片参数表

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

实验前期分别使用乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚3种有机溶剂进行实验，考查对应的回收率。结果显示，乙腈作为有机溶剂时，对氟他胺和羟基氟他胺的回收率最低，乙酸乙酯和叔丁基甲醚的极性与目标物更为接近，因此回收率较高。此外，虽然叔丁基甲醚沸点要比乙酸乙酯低，更有利于氮气浓缩，但乙酸乙酯的回收率要略高于叔丁基甲醚。因此综合考虑，最终选择乙酸乙酯作为提取溶剂。结果详见图1。

图1 不同提取剂对回收率的影响图

2.2 提取方式的选择

实验对比了摇床、超声和涡旋振荡3种提取方式。前期对比了提取5 min、10 min、15 min、20 min和25 min时回收率的差异，结果发现3种提取方式在同样提取时间(15 min）下，回收率基本能达到最优值，提取时间为15 min、20 min、25 min时，实验结果差别不大，因此为节省实验时间，选择提取时间为15 min。其中，涡旋振荡和摇床的提取方式要较超声提取更优，回收率均在90%以上。超声回收率只有70%～80%。实验结果显示，涡旋振荡和摇床回收率相当，最终选择摇床作为提取方式，结果见图2。

图2 不同提取方式对回收率的影响图

2.3 分散固相萃取剂的选择

实验对比了中性氧化铝、硅胶、C18、PSA、GCB和NH2等6种分散固相萃取剂。中性氧化铝主要是对目标物进行物理吸附，PSA和NH2对去除样品中的糖类杂质有较好效果，GCB则可以对具有平面结构的杂质进行吸附，虽然加入后，对基质效应有一定的改善，但同时也对目标物有较严重的吸附作用，因此回收率较低。而硅胶相对于其他分散固相萃取剂，对氟他胺和羟基氟他胺的吸附较少，C18对氟他胺和羟基氟他胺的影响最小，氟他胺和羟基氟他胺回收率均在90%以上，因此最终选择C18进行净化，不同分散固相萃取剂的回收率见图3。

图3 不同净化剂对回收率的影响图

进一步对C18用量进行优化，当用量为100～150 mg时，回收率较高，本实验选择100 mg为最佳用量，结果详见图4。

图4 不同净化剂用量对回收率的影响图

2.4 基质效应

直接提取的方式会使液态乳中的氨基酸、脂肪等物质提取至有机层，虽然方法使用了固相萃取剂进行净化，但氨基酸、脂肪等杂质的数量级要远大于目标化合物，因此很可能会存在基质效应，从而影响对数据结果的分析。实验为了探究基质效应，使用空白基质液配制基质曲线，以其斜率与纯溶剂曲线的斜率之比为判定依据。结果显示，氟他胺呈现基质抑制效应，基质效应为95.07%，在80%～120%，属于可接受范围。但羟基氟他胺呈现基质增强效应，基质效应为133.6%，对定量产生影响，所以用空白基质配制曲线进行定量。

2.5 线性关系和检出限

以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y进行曲线拟合，得到线性方程和相关系数R2。由表2可知，氟他胺和羟基氟他胺的曲线在1.0～100.0 μg·L-1线性关系良好，相关系数R2大于0.999。同时，通过低浓度加标，按信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10），测得氟他胺和羟基氟他胺的方法检出限均为2.0 μg·kg-1，定量限均为5.0 μg·kg-1，方法灵敏度较高，能满足测定要求。

表2 氟他胺和羟基氟他胺的线性方程、检出限和定量限表

2.6 回收率与精密度实验

以5.0 μg·kg-1、10 μg·kg-1、25 μg·kg-1的浓度水平进行加标回收实验，每个不同的添加水平于同一天内平行测定6次，并计算出相应的相对标准偏差。氟他胺和羟基氟他胺的平均回收率在94.8%～108.0%，RSD在1.58%～5.58%的范围内，说明在基质曲线校正定量的情况下，方法的回收率好。数据详见表3。

表3 不同水平的加标回收率和相对标准偏差表（n=6）

3 结论

本文采用分散固相萃取对提取液进行净化，通过配制基质曲线校正定量结果，对牛奶中的氟他胺和羟基氟他胺准确定性定量；结合飞行时间质谱测得精确分子量，对氟他胺和羟基氟他胺有较强的选择性，定性能力更为精确，相对于一般的串联质谱法，可排除假阳性情况的出现；回收率实验的结果表明，方法回收率好，精密度高。该方法对日常液态乳中氟他胺和羟基氟他胺的快速筛查和定量分析有较好的适用性，建立一个高通量筛查乳制品中人工喂养的雌激素或类雌激素的方法，对乳制品的质量安全监管有重大的意义。