王红波，连泽特，曹 强，范赛华，刘晓丽，马 挺

（1.中国石油新疆油田分公司实验检测研究院，新疆克拉玛依 834000；2.中国石油新疆油田分公司陆梁油田作业区，新疆克拉玛依 834000；3.南开大学生命科学学院，天津 300071）

新疆陆梁油田位于准噶尔盆地腹部古尔班通古特沙漠北部。其中，陆9 井区某油藏为具有基本统一油水界面的薄层、低幅度、高渗透和边底水砂岩油藏。随着采出体积的增大，注水量增幅较小，注采比不断下降。根据该油藏特征与储层物性，结合油水井动态数据分析，发现储层非均质性严重，导致油藏平、剖面矛盾突出，同时受油藏边底水和CaCl2水型的限制，有效提高采收率的方法比较单一，增产措施少。这样的砂岩油藏在新疆油田具有一定的代表性，目前从整体上还缺少抑制含水上升的有效技术手段。然而油藏剩余储量丰富，因此寻找新的技术手段就成了该区块提高油藏采收率和稳油控水的主要途径。

微生物采油技术是生物工程技术在油田开发领域的应用，具有低成本、适应性强、作业简单、无环境问题等优势［1］。微生物驱油技术即通过注入采油功能菌及其营养激活剂，使其在油藏中产生代谢作用和代谢产物，并与原油/岩石/水相互作用，从而提高水驱效率，达到提高油藏最终采收率的目的，具有油藏适应好、作用途径多、协同作用强、工艺简单、成本低等优势［2］。激活剂是决定微生物驱油效果的重要因素之一。因此，本文以工业发酵副产品和农业废弃物为激活剂的主要原料，筛选评价了适合于陆9 井区油藏的激活体系配方，定向激活油藏中的主要采油功能菌，发挥微生物驱的优势，实现陆9井区油藏的稳油控水和经济有效开发。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

豆饼粉、C1（农副产品加工废料，有机氮质量分数7.31%）、C2（农副产品加工废料，有机碳质量分数20.21%）、豆粕、颗粒状肥料等，工业级，天津市利发隆化工科技有限公司；乙酸钠、红糖、蔗糖、甘油、N1（含氮无机盐，含氮量26.16%）、N2（含氮无机盐，含氮量16.47%）、尿素、磷酸氢二胺、磷酸二氢铵、正十二烷，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；荧光定量PCR 分析试剂组成：溶菌酶、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris 饱和酚、氯仿、乙醇、Roche 荧光定量试剂盒，北京鼎国生物技术有限责任公司；超纯水；PCR 引物，北京奥科生物技术有限责任公司；环氧树脂胶结驱油用岩心，取自中国石油新疆油田分公司岩心库；油水样采集自新疆某砂岩油藏油田陆9井区某一层位油藏，地层水矿化度10298.89 mg/L，主要由Na+、Cl-、HCO3-等离子组成。

ZQZY-70 BS 摇床，上海知楚仪器有限公司；Yamato SQ 510 C 灭菌锅，日本大和科学株式会社；JJ-4 A 水浴锅，金坛市城东新瑞仪器厂；Vortex 2 振荡器，美国Scientific Industries公司；BCD-195冰箱，河南新飞电器集团有限公司；物模驱油装置、HKY-1型岩石超声波综合测试仪，海安石油科研仪器公司；氮气瓶；不锈钢耐压容器1、2 L各1个；油水分离计量器，天津市泰源工业气体有限公司；MyuQTM2 Opitics Module 实时荧光定量PCR 仪、Bio-Rad iQ 5 PCR，美国伯乐生命医学产品（上海）有限公司；JIN26 高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特（Beckman Coulter）有限公司；Universal 320 R台式高速冷冻离心机，德国Hettich科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

微生物提高原油采收率主要通过微生物本身及其代谢产物两方面作用［3］。为了便于室内激活体系配方的优化，依据激活剂激活效果评价方法，本着简单易行、有效合理的原则，确立了以激活前后水样总菌数变化、硫酸盐还原菌（SRB）数量变化和对原油的乳化作用效果作为评价激活效果的主要指标。

（1）乳化评级方法

激活剂乳化评级方法参照代学成等［4］描述的油水乳化效果评分标准，主要观察微生物激活培养后分散乳化原油的能力。该方法简单易行，用肉眼根据经验判定营养配方的乳化效果，判定结果存在人为因素的误差［5］。

（2）排油圈法

排油圈法是公认的简便准确的评估样品乳化效果的实验方法［6］。具体步骤为：在培养皿（直径=90 mm）中加入60 mL的热水，再加入10 mL经苏丹Ⅲ染色的正十二烷（需过滤除菌）；待正十二烷铺满整个平板后，在其表面加入1 mL 待测样品，用刻度尺测量排油圈直径大小，若排油圈直径大于3 cm，即认为培养液中存在表面活性剂。

（3）荧光定量PCR方法

荧光定量PCR 是通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法［7］。对于油藏环境而言，烃氧化菌、硝酸盐还原菌及表面活性剂产生菌这几类功能微生物与微生物采油技术密切相关，因此定量分析这些功能基因有助于更加清晰地认识和判断油藏环境中的微生物群落。选择与原油乳化分散效果密切相关的编码鼠李糖脂的鼠李糖基转移酶rhlAB基因、脂肽类表面活性剂合成酶srfA基因、与烷烃降解相关的烷烃加氧酶alkB基因进行群落相关功能菌的定量PCR分析。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物

因编码烷烃加氧酶的alkB基因包含细胞色素P450氧化酶和细菌颗粒状烷烃羟化酶两大类，因此在设计alkB基因的PCR引物时，需设计多对特异性引物及接头引物。用实验室构建的CPY153标准质粒绘制标准曲线，以设置优化出最佳的多对特异性引物添加量以及接头引物的添加量，具体设计方法和15 对引物序列见参考文献［8］，扩增运行程序见表2。其中，16S rRNA、srfA、rhlAB基因的体系组成为：10 μL SYBRGreen Mastermix、9 μL超纯水、引物1 和引物2 各0.05 μL、1 μL DNA 模板；alkB 基因的体系组成为：10 μL SYBRGreen Mastermix、9 μL 超纯水、0.05 μL 引物、1 μL DNA 模板。其中，alkB基因体系配制的第1步按表2进行；第2步在每个体系中加入0.8 μL 的接头引物（JP），用台式高速冷冻离心机混匀后使用荧光定量PCR仪进行定量分析。

表2 4类功能基因PCR扩增运行程序

（4）Plackett-Burman实验

参照参考文献［9］进行Plackett-Burman（简称P-B）实验。P-B实验设计建立在平衡的非完全区组基础上，通过N个实验（N为4的倍数）来分析N-1个变量的两水平实验设计方法。和传统的单因素实验相比，可以利用最少的实验次数快速有效地在众多考察因素中列出重要性排名，找出主要影响因素。

在初步优化营养剂配方的基础上，利用Minitab软件（美国宾夕法尼亚州州立大学）进行P-B实验设计［10］。选 择 Stat＞Factorial＞Analysis Factorial Design，生成的实验设计如表3 所示。依照Minitab设计的12水平配方进行显著性分析实验，每个水平设置3 个平行，在37 ℃、180 r/min 条件下培养7 d。实验结束后，取2 mL 激活后的油水样提取基因组，采用荧光定量PCR技术对基因组中的rhlAB和srfA进行定量分析。

表3 Plackett-Burman实验设计表

（5）物模驱油实验

参照常规的物模驱油实验［11］，向岩心中注入地层水，直至出口含水率为98%为止，记录出水量、出油量以及相对应的时间与压力。第1次水驱结束后注入0.5 PV 菌株发酵液，注入速度为1 mL/min，密封岩心夹持器后培养7 d，再将地层水注入岩心，直至出口含水率为98%为止，计算提高采收率值。

2 结果与讨论

2.1 廉价营养体系的初筛及单因素实验

根据油藏水质分析结果、微生物群落组成和生长的营养需求，结合当前国内外已报道的激活体系组成，以及现场配方的组成分析（0.275% C2、0.125% C1、0.6% N2、0.25% N1），确定基础配方为0.25%C2、0.2%豆饼粉、0.25%N1、0.6% N2。综合考虑激活体系筛选原则和激活对象的实际情况，以碳源、氮源、磷源、生长因子和SRB 抑制因子为出发点，进行单因素实验初步确定基础激活配方。用250 mL三角瓶进行好氧培养，培养温度37 ℃，摇床转速为180 r/min，培养时间7 d。培养结束后进行乳化性能评价和功能菌的检测。可以根据激活体系激活后的原油乳化效果及功能菌激活的总菌数评价激活体系的好坏［4］。

碳源的筛选。在现场激活配方基础上，以乙酸钠、红糖、C2、蔗糖、甘油、原油（唯一碳源）为碳源进行水样激活实验，控制其他营养成分和组成不变。结果表明，乙酸钠和C2的激活效果最好，激活后油水样微生物16S rRNA 基因拷贝数达到了1012copies/mL以上，乳化评级也达到+++（+的数量对应于参考文献［4］中乳化评级方法的0～5 分）；蔗糖、红糖的激活效果稍差，乳化评级为++；甘油和原油的激活效果最差，乳化评级为+。

氮源的筛选。在现场激活配方基础上，以N1、N2、豆饼粉、C1、尿素、豆粕为氮源进行水样激活实验，控制其他营养成分和组成不变。结果表明，N1、N2、豆饼粉、C14 组氮源的微生物16S rRNA 基因拷贝数均达到了1012copies/mL 以上，乳化评级达到+++（C1为++++）。尿素、豆粕的激活效果较差，乳化评级为+。

磷源的筛选。在现场激活配方基础上，以颗粒状肥料、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、C1为磷源进行水样激活实验，控制其他营养成分和组成不变。结果表明，磷酸氢二胺、磷酸二氢铵等无机磷源（添加量为0.2%）与陆9井区氯化钙型地层水形成不溶性沉淀，会造成地层堵塞，无法应用于该区块的激活。C1、颗粒状肥料2种磷源都达到了出色的乳化效果，微生物16S rRNA 基因拷贝数大于1012copies/mL，乳化评级为++++。

综合单因素实验结果和激活配方筛选原则，确定初步配方为：0.10%C1、0.25%C2、0.15%颗粒状肥料、0.6%N2、0.3%N1。

2.2 Plackett-Burman实验

依据表3 设计开展营养剂激活实验，培养结束后提取基因组，对rhlAB和srfA进行定量分析，将上述功能基因拷贝数输入软件获得乳化效果综合得分拟合方程：

在Minitab软件菜单中选择Stat＞Facterial＞Facterial Plots，生成各因素对输出变量（Y值）的影响图。通过分析主要影响图可知各因素的显著性［10］，结果见表4。

由表4 可见，C1、颗粒状肥料的效应为正，加量增大对乳化效果为正响应，即适当增大加量可提高乳化评级分数；C2、N2、N1的效应为负，加量减少对乳化效果为正响应，即适当减少加量可提高乳化评级分数。但5 个营养因子的P值不具有统计学意义（P＞0.05），因此无法通过Plackett-Burman实验得出各营养因子对乳化效果的显著性结果。

表4 响应值（乳化评分）的估计效应和系数

在颗粒状肥料加量为0.1%时能有效激活陆9井区地层水中的功能微生物，激活后的油水样品能达到良好的乳化效果。颗粒状肥料来源为工业肥料回收再利用，虽然价格低廉，激活效果良好，但颗粒为直径3～5 mm的实心球状体，溶解较为困难，而碾碎溶解后，有较多不溶性片状杂质（长度约为5 mm），在地层中易造成非选择性封堵。因此，在后续实验中，不再使用颗粒状肥料进行实验。而C1含磷量为2.4%，在单因素结果中，C1作为磷源表现了良好的乳化效果，因此在后续实验中使用C1作为磷源。

2.3 去因子实验

2.3.1 营养配方设计

由于不同水平的营养因子添加量下，激活后样品总菌数和功能基因的数量级无显著性差异（P＜0.05），无法准确判断各因素的最佳水平。另外，考虑工业成本的可行性，由单因素实验得到的初步配方出发，在Plackett-Burman 实验的基础上进行更为直观的去因子实验，在保证激活效果的同时节约成本，实现最优的资源利用。设计的7 组配方见表5。在37 ℃、180 r/min 条件下培养7 d。培养结束后进行乳化评级、功能基因定量PCR分析。

表5 去因子实验营养配方组成

2.3.2 营养配方优化结果

用乳化评级和排油圈法共同测定不同营养配方的乳化效果，结果见表6。配方C 的乳化效果最好，排油圈直径4.0 cm。

表6 7组营养配方去因子实验结果

用实时荧光定量PCR 技术分别测定7 组营养配方的16S rRNA 基因、alkB基因、srfA基因、rhlAB基因，分别测定解烃基因、脂肽基因、鼠李糖脂基因的拷贝数，结果见表7。

表7 实时荧光定量检测功能基因拷贝数

综上，7组去因子实验激活结果表明，配方C和配方G 的激活效果显著，无沉淀与不溶性杂质出现，配方与水样的配伍性良好，乳化评级均为5 分。功能基因定量结果显示解烃菌alkB基因均达到了107copies/mL，脂肽产生菌srfA基因均达到了105copies/mL，鼠李糖脂产生菌rhlAB基因均达到了104copies/mL。

2.4 响应面分析结果

响应面法是通过近似构造一个具有明确表达形式的多项式来表达因式功能的函数［12］。借助Minitab 5.0 软件，采用二次回归的旋转中心组合设计，进行实验设计和激活体系配方优化。对实验数据进行回归拟合，对拟合方程作显著性检验和方差分析［13］。选择 配方C，并 以0.15% C1、0.6% N2、0.25% N1作为0 水平进行3 因素20 水平响应面分析。分析结果（表8）表明，C1和N1为负响应因素，可适当减少添加量；而N2为正响应因素，可适当增加添加量。

为了更为准确地评估不同水平的添加量响应结果，进行了20 水平的荧光定量PCR 分析（图1）。实验结果表明，20水平的配方加入量对功能基因数量级的响应在1个数量级之内，表明3个因素的3个水平任意组合均不会对激活效果造成较大波动。N2不仅作为优良氮源，同时还可以促进硝酸盐还原菌的生长代谢。由于硝酸盐还原菌的生态位在硫酸盐还原菌之上，且硝酸盐还原菌的适当富集可以有效抑制硫酸盐还原菌的生长，因此不降低N2的添加量。C1作为辅助氮源之外，更重要的作用是提供微生物生长代谢所必须的磷源（C1中的无机磷含量为0.7%），因此不降低C1的添加量。与0 水平的N1（0.25%）相比，低水平N1（0.2%）的激活效果及功能基因的数量级并无明显差异，因此可以适当降低N1的加量。当N1的加量为0.25%时，配方成本为27.43元/方，已较现场配方降低了20.25%。为了更好地确保激活效果，N1的加量不再降低。最终激活体系配方为：0.15%C1、0.6%N2、0.25%N1。与徐兵等［13］对陆9 井区内源微生物优化后的激活配方相比，成本已大大降低。

图1 荧光定量PCR 16S rRNA、srfA、rhlAB、alkB基因每毫升拷贝数

2.5 物模驱油结果

模拟陆9 井区油藏条件开展物理模拟驱油实验，结果见表9。当优化配方注入量为0.1～0.6 PV时，驱油效率提高2.65 百分点～5.92 百分点。在注入0.6 PV 的实验过程中，注入量达到0.55 PV 时出现激活体系突破。从物理模拟提高采收率效果来看，0.6 PV提高驱油效率5.92百分点，仅比0.4 PV多0.55 百分点。表明在驱替突破后，后续激活剂的注入并没有进一步提升地层微生物乳化原油的能力，而突破后的激活体系则造成浪费，因此选择0.4 PV作为最佳注入量。在相同条件（0.4 PV，优化配方）下，进行注气量的优化实验。优化配方不注气的条件下提高驱油效率5.37百分点。优化配方注气（气液体积比8∶1）的条件下提高驱油效率11.65 百分点，高于代学成等［4］制定的激活配方筛选评价指标（6百分点～9百分点）。

表9 物模驱油实验结果

2.6 现场应用

陆9 油藏微生物驱先导试验于2017 年11 月开始现场实施，应用的营养体系为本文所筛选的激活体系。试验区4 口注入井，设计注入营养体系21.75×104m3（折算孔隙体积0.1 PV），预计增油4.98万吨，提高采收率3.5%。截至2020 年10 月25 日，试验区注剂15.13×104m3。完成总方案的69%。目前现场试验效果处于高峰期，陆9 微生物驱矿场试验累积核实增产1.8×104t，阶段提高采收率1.3%，平均单井日产油3.1 t，微生物驱效果明显。

3 结论

针对陆9井区砂岩油藏主要采油功能菌的营养需求，筛选出一套高效而廉价的营养体系。该体系乳化原油效果较好，激活主要采油功能基因烃氧化基因达到107copies/mL，脂肽产生菌srfA基因均达到了105copies/mL，鼠李糖脂产生菌rhlAB基因均达到了104copies/mL；物模驱油实验提高采收率11.65百分点。

体系选取工业发酵副产品和农业废弃物为激活剂的主要原料，与现场在用配方相比，注入药剂成本显著降低20.25%。配方成分廉价易得、便于运输和储存，适合油田低成本开发的需要，具有良好的应用价值。

通过单因素试验、Plackett-Burman实验、去因子实验、响应面实验等，并结合微生物激活评价方法，形成一套微生物激活剂筛选评价方法流程，为今后开展微生物驱激活剂筛选评价提供借鉴。