韩秀梅，吴亚维，冯建文，宋莎，杨华，李顺雨

（1贵州省农业科学院果树科学研究所，贵州贵阳550006；2威宁县现代高效农业产业示范园区管理委员会，贵州毕节553100；3威宁县特色经果林产业发展中心，贵州毕节553100）

0 引言

【研究意义】贵州高海拔区属于我国南方苹果优生区，低纬度、高海拔，日照充足，温度年较差小，夏季气候冷凉，果实成熟期昼夜温差大，果实品质和风味佳。香气是评价果实风味品质的重要指标（Kulkarni et al.，2012），不同苹果品种间香气成分种类和含量均存在差异，香气成分可作为苹果品种选育的评价指标之一，选择香味浓郁的品种作为亲本是改善果实香气形成的主要途径（王怡玢等，2018；刘俊灵等，2019）。因此，开展西南高海拔区域苹果香气成分和相对含量特征研究，可为该区域品种评价、品质调控和培育特殊香气的苹果种质提供依据。【前人研究进展】水果中挥发性成分的种类和含量是评价果实风味品质的重要指标，能客观反映不同水果的风味特点，酯类、醇类和醛类是苹果中主要的香气成分（王怡玢等，2018）。根据消费者对不同化学结构香气成分的感官效果，水果香气可分为果香型、甜香型、青香型、辛香型、木香型和醛香型（程焕等，2016）。根据苹果香气物质成分的构成，分为水果甜香型和青香型两大类；其中，酯类物质作为苹果香味最重要的贡献者，主要表现为甜香型，是成熟果实中果香气味的主要来源，而醛类、烯烃类及醇类主要表现 为 青 香 型（Bayramoğlu et al.，2011；程 焕 等，2016）。海拔高度会影响苹果香气成分，随着海拔的升高，挥发性物质总量呈先升后降的变化趋势（刘潇然等，2018）。阎振立等（2007）研究发现同一地区高海拔果园有利于华冠苹果果实酯类和醛类的积累与释放，低海拔果园有利于果实醇类、烷类和酮类香气物质的积累。何义等（2014）报道在河北省海拔较高的承德、石家庄和邢台，富士苹果果实酯类和醛类含量较高，而在海拔较低的秦皇岛和保定，醇类含量较高。不同品种果实的香气存在明显差异，富士苹果由国光×元帅杂交选育，属于酯香型（Echeverrıˊa et al.，2004a），王林苹果是从金冠×印度的杂交实生苗中选出，果实品质表现为果肉硬而脆、多汁、味甜，有香味且耐贮运，香气成分以低分子的醛类、醇类和酯类为主，3类物质的相对含量占总挥发物质的90%左右（许宝峰等，2014）；维纳斯黄金是金冠自然杂交后代中选育的优良品种，果实具有浓郁清新的芳香味，也是典型的酯香型苹果（王树波等，2015）。【本研究切入点】西南冷凉高地是我国南方唯一的苹果优生区，低纬度、高海拔，夏季气候冷凉，年温差小，昼夜温差大，使得该区域苹果形成独特的品质特征。目前，有关西南高海拔区苹果挥发性物质特征的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】富士是威宁主栽苹果品种，王林和维纳斯黄金有一定栽培面积，且这2个品种果实香气浓郁，本研究采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱—质谱联用技术（GCMS），对威宁高海拔区3个苹果品种果肉的挥发性物质进行类别鉴定和含量测定，分析挥发性物质组分特征，旨在为该区域品种筛选及品种选育亲本选择提供参考信息，同时为解析我国高海拔区域苹果品质形成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

果实样品采自贵州省威宁县牛棚镇3年生的烟富3、王林和维纳斯黄金矮化中间砧植株，基砧为丽江山荆子，中间砧为SH，果园株行距2 m×4 m，树形为细长纺锤形，果实未套袋。2019年，每个品种选6株立地栽培条件和生长势基本一致的植株，采取相同的管理技术，10月份于果实成熟期，每株树从不同部位均匀采摘6个果实带回贵州省果树科学研究所实验室处理，同一品种每株树采集的果实为1个重复，分别从每个果实的纵剖面和横剖面取0.5 cm厚薄片，切成0.5 cm小块，液氮冷冻处理，冷冻干燥后于-80℃储藏待测。

1.2 试验方法

1.2.1 提取方法从-80℃冰箱中取出样品，在液氮中研磨成粉末，每个样本称取约1 g研磨样品置于15 mL顶空瓶中，分别加入2 mL饱和NaCl溶液和10μL 61μmol/L内标乙酸苯乙酯溶液，加盖密封，在60℃恒温条件下振荡10 min。采用全自动HSSPME（SPME Allow Cond CTC Analytics AG）进行样本萃取，将萃取头（50/30μm DVB/CAR/PDMS，Sigma）插入样品顶空瓶，顶空萃取20 min，于250℃下 解 析5 min，然 后 进 行GC-MS（Agilent 8890-5977B）分离鉴定。采样前后萃取头分别在老化装置（Fiber Conditioning Station CTC Analytics AG）中加热老化5 min。

1.2.2 色谱条件DB-5MS毛细管柱（30 mm×0.25 mm×0.25μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA，USA），载气为高纯氮气（纯度≥99.999%），恒流流速1.0 mL/min，进样口温度250℃，不分流进样，溶剂延迟3 min。程序升温：40℃保持5 min，以6℃/min升至280 °C，保持5 min。

1.2.3 质谱条件电子轰击离子源（EI），离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质谱接口温度280℃，电子能量70 eV，扫描方式为全扫描模式（SCAN），质量扫描范围：质荷比50～500 aum。

1.2.4 定性与定量GC-MS分析获得的原始数据文件，首先由MassHunter软件（Agileng）进行提取，根据质荷比及保留时间等信息，质谱图经计算机检索同时与NIST 14质谱库相匹配，保留匹配率60%以上的数据，确认各种挥发性成分；定量方法按峰面积归一化法求得各成分相对含量，并参照内标进行归一化处理。

1.3 数据处理

利用Excel 2007处理试验数据，各成分相对含量采用Z-Score归一化处理后，利用SIMCA-P 11.5进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），MeV 4.8.1对物质在不同样本间的积累模式绘制热图并进行聚类分析，以SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 总代谢物PCA和聚类分析结果

由总样本的PCA分析图（图1）可知，3个苹果品种果实的6个检测样本均相对集中，主成分1和主成分2的得分分别为28.69%和24.47%，维纳斯黄金6个样本主要聚集在图左上方，烟富3的6个样本主要分布在图右下方，王林6个样本主要分布在图右上方。从总样本聚类热图（图2）可看出，烟富3、王林和维纳斯黄金3个品种各自的6个样本均分别聚在一起，PCA和聚类分析结果均未发现离散样本，说明样本数据可信。同时，从聚类热图可看出，烟富3与王林的代谢谱特征更相似，维纳斯黄金单独聚为一类。乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸己酯、环己醇、环己烷、正己烷、（Z）-2-庚醛、2-庚酮和2,6-二甲基-4-庚酮等挥发性物质聚在一起，这些物质相对含量在维纳斯黄金果肉中最高。丁酸丙酯、丙酸丁酯、2-甲基-1-丁醇、乙酸2-甲基丁酯、2-甲基丁酸丙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯和辛酸乙酯等物质聚在一起，这些物质相对含量在烟富3中最高。丁酸己酯、己酸己酯、1-己醇、2-甲基丁酸丁酯和2-甲基丁酸己酯等挥发性物质聚在一起，这些物质相对含量在王林果肉中最高。

2.2 总代谢物类别分析结果

3个苹果品种果实共鉴定出挥发性物质93种，其中，酯类19种、醛类11种、酮类11种、醇类5种、烯烃类5种、烷烃类28种、胺类5种、其他类9种。3个苹果品种共有挥发性物质90种，烟富3的烯烃类挥发性物质较王林和维纳斯黄金多2种，王林果肉中检测到其他类挥发性物质8种，较烟富3和维纳斯黄金果肉中检测到的其他类挥发性物质少1种（表1）。

2.3 挥发性香气成分分析结果

3个苹果品种果实样品中，挥发性物质主要为酯类、酮类、醇类和醛类。19种酯类挥发性物质中，有16种相对含量在3个品种果实之间存在显著差异（＜0.05，下同）；11种醛类挥发性物质中，有8种相对含量在3个品种果实之间存在显著差异；11种酮类挥发性物质中，有6种相对含量在3个品种果实之间存在显著差异；5种醇类挥发性物质中，有4种相对含量在3个品种果实之间存在显著差异（表2）。从不同种类挥发性物质峰面积占比来看，酯类挥发性物质峰面积占比最高，达54.73%～58.06%，其次为酮类挥发性物质，峰面积占比为18.58%～20.13%，3个品种果实的挥发性物质均以酯类代谢物为主。酯类、醛类、酮类和醇类是水果主要的挥发性物质，从这4类挥发性物质在3个苹果品种果肉中相对含量来看，烟富3果肉中酯类挥发性物质相对含量高于王林和维纳斯黄金，而醛类物质相对含量最低；王林果肉中醇类挥发性物质相对含量高于烟富3和维纳斯黄金，而酮类挥发性物质相对含量最低；维纳斯黄金果肉中酮类和醛类挥发性物质相对含量高于烟富3和王林，而酯类挥发性物质相对含量较另外2个品种低。

2.3.1 酯类挥发性物质分析 酯类物质中，辛酸乙酯相对含量最高（30.96%～33.76%），其次为庚酸乙酯，相对含量占总含量的17.53%～18.48%，第三是乙酸2-甲基丁酯，其相对含量占总含量的1.15%～3.32%，这3种酯类挥发性物质均表现为烟富3果肉显著高于王林和维纳斯黄金，而后两者间无显著差异（＞0.05，下同），尤其是乙酸2-甲基丁酯，烟富3果肉中相对含量分别是王林和维纳斯黄金的2.59和2.89倍。2-甲基丁酸己酯相对含量占总含量的0.31%～2.18%，丁酸己酯相对含量占总含量的0.20%～0.98%，2-甲基丁酸丁酯相对含量占总含量的0.09%～0.32%，王林果肉中这3种酯类挥发性物质含量显著高于烟富3和维纳斯黄金，其中，王林果肉中2-甲基丁酸己酯相对含量分别是烟富3和维纳斯黄金的2.91和7.03倍，丁酸己酯相对含量分别是烟富3和维纳斯黄金的4.90和2.65倍，2-甲基丁酸丁酯相对含量分别是烟富3和维纳斯黄金的2.13和3.56倍。乙酸己酯相对含量占总含量的0.42%～2.38%，乙酸丁酯相对含量占总含量的0.13%～0.69%，乙酸戊酯相对含量占总含量的0.05%～0.19%，反式-2-己烯基乙酸酯相对含量占总含量的0.03%～0.17%，维纳斯黄金果肉中这4种酯类挥发性物质相对含量均显著高于烟富3和王林。乙酸己酯相对含量分别是烟富3和王林的5.67和1.98倍，乙酸丁酯相对含量分别是烟富3和王林的5.31和2.30倍，乙酸戊酯相对含量分别是烟富3和王林的3.80和2.11倍，反式-2-己烯基乙酸酯相对含量是烟富3和王林的5.67倍。

2.3.2 醛类挥发性物质分析从醛类挥发性物质相对含量来看，反-2-己烯醛的相对含量最高，占总含量的1.13%～1.35%，其次为己醛，占总含量的0.11%～0.22%，第三是（E,E）-2,4-己烯醛，占总含量的0.08%～0.15%，第四是3-己醛，占总含量的0.03%～0.12%。烟富3果肉中的反-2-己烯醛和反-2-辛烯醛相对含量显著低于王林和维纳斯黄金，而（E,E）-2,4-己烯醛和3-己醛相对含量显著高于王林和维纳斯黄金；维纳斯黄金果肉中己醛相对含量显著高于烟富3和王林，分别是二者的2.00和1.69倍；王林果肉中苯甲醛含量分别是烟富3和维纳斯黄金的1.83和1.57倍。

2.3.3 酮类挥发性物质分析酮类挥发性物质中，2,6-二甲基-4-庚酮的相对含量最高，占总含量的8.50%～8.95%，其次为3-甲基-2-丁酮，占总含量的5.97%～6.94%，第三是2-庚酮，占总含量的3.22%～3.58%，第四是4,6-二甲基-2-庚酮，占总含量的0.24%～0.26%，这4种酮类挥发性物质均是在维纳斯黄金果肉中相对含量最高。维纳斯黄金果肉中3-甲基-2-丁酮的相对含量显著高于王林，但与烟富3无显著差异，2,6-二甲基-4-庚酮、2-庚酮和4,6-二甲基-2-庚酮均表现为维纳斯黄金果肉显著高于烟富3和王林。

2.3.4 醇类挥发性物质分析从醇类挥发性物质相对含量来看，1-辛醇相对含量最高，占总含量的4.34%～4.73%，其次为1-己醇、4,4-二甲基-2,5-二氧-1-咪唑烷甲醇、2-甲基-1-丁醇和环己醇相对含量较高，分别占总含量的0.30%～1.01%、0.73%～0.80%、0.03%～0.42%和0.03%～0.16%。维纳斯黄金果肉中1-辛醇和环己醇相对含量显著高于烟富3和王林，其中1-辛醇是烟富3和王林的1.05和1.09倍，环己醇是烟富3和王林的5.33倍；王林果肉中1-己醇的相对含量显著高于烟富3和维纳斯黄金，分别是二者的3.37和2.24倍；烟富3果肉中2-甲基-1-丁醇相对含量显著高于王林和维纳斯黄金，分别是二者的3.23和14.00倍。

2.3.5 烷烃类及其他挥发性物质分析烷烃类物质主要是环己烷和正己烷，其相对含量分别占总含量的1.56%～1.88%和1.56%～1.87%。5种烯烃类挥发性物质中，烟富3果肉中D-柠檬烯相对含量显著高于王林和维纳斯黄金，（-）-γ-卡丁烯和长叶烯是烟富3

果肉中特有的烯烃类挥发性物质，3个品种果肉中的苯乙烯和（1R）-2,6,6-三甲基双环［3.1.1］庚-2-烯相对含量无显著差异。5种胺类挥发性物质中，N,N-二甲基-3-甲氧基-4-甲基苯乙胺相对含量最高，占总含量的1.24%～1.33%，烟富3果肉中相对含量显著高于王林和维纳斯黄金；其次为N,N-双（1-甲基乙基）-1,2-乙二胺，占总含量的0.39%～0.43%，维纳斯黄金果肉中相对含量显著高于烟富3和王林，其余3种胺类挥发性物质在3个品种果肉中无显著差异。其他挥发性物质中，1,3-双（1,1-二甲基乙基）-苯、3,4-二羟基-5-氨基哒嗪和羟基乙腈相对含量较高，分别占总含量的2.56%～2.66%、2.11%～2.32%和1.56%～1.83%。

3 讨论

3.1 高海拔区域3个苹果品种成熟果实挥发性物质特征

苹果现已测定出300多种挥发性物质，主要是酯、醇和醛类物质（王海波等，2007；曾辉，2016；王怡玢等，2018）。苹果主要香气成分有水果甜香型和青香型（青草味），其中，酯类化合物主要表现出甜香特征，而醛类、醇类、酮类和烯烃类主要表现出青香特征（Buettner and Schieberle，2001）。醛类、酯类、醇类、萜类和酮类等化合物以一定比例存在于果实周围或内部，构成了各个品种独特的典型香味（刘俊灵等，2019）。

酯类是苹果的主要挥发性物质，红富士苹果香气属于酯香型（Echeverrıˊa et al.，2004a），而酯香型又可分为乙酸酯型、丙酸酯型、丁酸酯型和乙醇酯型（卢明艳等，2017），富士苹果为乙酸酯型（Echeverria et al.，2004b；厉恩茂等，2018）。孙燕霞等（2020）报道维纳斯黄金成熟果实中酯类挥发性物质相对含量达74.15%，其中，乙酸乙酯相对含量最高（20.06%）。关于王林苹果果实香气成分的研究报道存在一定差异，乜兰春等（2006）报道，乙酸乙酯、丁酸乙酯和乙醇是王林成熟果实中主要挥发性物质，乙酸乙酯相对含量最高（46.34%）。许宝峰等（2014）报道王林苹果成熟果实中醛类物质占80%左右。刘俊灵等（2019）发现王林苹果成熟果实酯类挥发性物质相对含量达61.92%，2-甲基丁酸己酯相对含量最高（14.25%），其次为乙酸己酯（13.29%）。王林苹果果实主要挥发性物质研究报道方面的差异，可能由于检测方法或果实产地差异所致（李晓磊等，2008）。本研究结果显示，烟富3、王林和维纳斯黄金3个品种果实挥发性物质均以酯类为主，果肉香气属于酯香型，与前人研究结果（乜兰春等，2006；厉恩茂等，2018；刘俊灵等，2019；孙燕霞等，2020）一致，而3个品种果实相对含量最高的2种酯类挥发性物质均为辛酸乙酯和庚酸乙酯，这2种酯类挥发性物质相对含量占总挥发性物质的48.56%～52.24%，与前人研究结果（乜兰春等，2006；厉恩茂等，2018；刘俊灵等，2019；孙燕霞等，2020）存在一定差异。

已有研究结果表明，王林成熟果实中醇类挥发性物质主要是E-2-辛烯醇（刘俊灵等，2019）或2-甲基丁醇（乜兰春等，2006），醛类挥发性物质主要是己醛、2-己烯醛和反式-2-己烯醛（乜兰春等，2006；许宝峰等，2014；刘潇然等，2018；刘俊灵等，2019）；富士成熟果实中醇类挥发性物质主要是1-丁醇和2-甲基丁醇（乜兰春等，2006）；维纳斯黄金成熟果实中醇类挥发性物质主要是正己醇和正丁醇（孙燕霞等，2020），醛类挥发性物质主要是正己醛和（E）-2-己烯醛（孙燕霞等，2020）。苹果中酮类物质主要有6-甲基-5-庚烯-2-酮（刘俊灵等，2019）和甲基庚烯酮（孙燕霞等，2020），且酮类挥发性物质的相对含量均小于0.5%（刘俊灵等，2019；孙燕霞等，2020）。本研究发现，产自威宁的3个苹果品种果实中醇类挥发性物质主要是1-辛醇、1-己醇和2-甲基-1-丁醇，醛类挥发性物质主要是反-2-己烯醛，酮类挥发性物质主要是2,6-二甲基-4-庚酮、3-甲基-2-丁酮和2-庚酮，酮类物质相对含量达18.58%～20.13%，酮类挥发性物质与已有报道不同，且相对含量远高于已有报道（刘俊灵等，2019；孙燕霞等，2020）。辛酸乙酯有水果香气，并有菠萝、苹果样的香韵和白兰地的酒香味（郭清云等，2021），庚酸乙酯具有菠萝香气味，1-辛醇具有柠檬气味，1-己醇具有水果芬芳香气，2-甲基-1-丁醇有令人愉悦的气味，高浓度反-2-己烯醛具有强烈青草气味，浓度为0.1%以下时呈新鲜水果型清香（刘潇然等，2018；万鹏等，2019），2,6-二甲基-4-庚酮有薄荷味，2-庚酮有类似梨的水果香味，3-甲基-2-丁酮具有芳香气味。这些挥发性物质种类和相对含量的差异及其特殊香气，可能是形成该区域苹果独特风味的关键因素之一，而我国西南低纬度高海拔地区独特的环境条件可能是导致苹果果实中挥发性物质成分差异的主要原因。

3.2 3个苹果品种成熟果实特征性挥发性物质

尽管3个苹果品种果实的主要挥发性物质一致，但品种之间挥发性物质仍存在明显差异。烟富3果实中乙酸2-甲基丁酯、（E,E）-2,4-己烯醛、3-己醛、2-甲基-1-丁醇、D-柠檬烯显著高于王林和维纳斯黄金，（-）-γ-卡丁烯和长叶烯是烟富3果实中特有的挥发性物质。乙酸2-甲基丁酯呈现甜的果香似香蕉气息，3-己醛为青草味型，（E,E）-2,4-己烯醛为绿苹果味型（万鹏等，2019），D-柠檬烯具有新鲜橙子香气及柠檬香气。王林果实中2-甲基丁酸己酯、丁酸己酯、丁酸丁酯和1-己醇相对含量显著高于烟富3和维纳斯黄金，其中2-甲基丁酸己酯具有强烈的水果青香香气，丁酸己酯呈青香、果香、酯香、蔬菜香及强烈的混合水果香气和菠萝香昧，丁酸丁酯具有苹果香味，1-己醇具有青草味香气（王海波等，2010；刘潇然等，2018；万鹏等，2019）。维纳斯黄金果实的乙酸己酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、反式-2-己烯基乙酸酯、己醛、反式-2-壬烯醛、2,6-二甲基-4-庚酮、3-甲基-2-丁酮和2-庚酮相对含量显著高于烟富3和王林，其中乙酸己酯具有令人愉快的水果香气和梨似的酸甜味道，乙酸丁酯具有强烈的水果香气，乙酸戊酯有果子香味（王海波等，2010），反式-2-己烯基乙酸酯和己醛具有青草气及苹果香味，反式-2-壬烯醛呈鸡和烤猪肉香气，稀释至1 mg/kg时呈黄瓜香味（刘潇然等，2018；万鹏等，2019）。果实香气成分的种类和比例构成了不同香型，形成不同浓郁程度的香气（郭清云等，2021），3个苹果品种成熟果实中挥发性物质种类和含量的差异，导致其呈现不同的香气特征，而特征挥发性物质的发掘，也为培育具有不同香气苹果新品种亲本的选择提供参考依据。

4 结论

在西南冷凉高地威宁高海拔区域，酯类是烟富3、王林和维纳斯黄金3个苹果品种成熟果实的主要挥发性物质，辛酸乙酯、庚酸乙酯、2,6-二甲基-4-庚酮、3-甲基-2-丁酮、乙酸2-甲基丁酯和1-辛醇是影响该区域苹果风味的主要香气物质。