王奕博，钟荣荣，范亚楠，周旭，孙晓丛，陈彦琳，杜杰

中国中药有限公司，北京 102600

淡豆豉又名豉、淡豉、香豉、大豆豉等，是豆科植物大豆成熟种子的发酵加工品，具有解表、除烦、宣发郁热之功，常用于治疗感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠等[1]。现代研究表明，淡豆豉具有抗肿瘤、抗骨质疏松、降血糖、调血脂等功效，其有效成分包括大豆苷元、γ-氨基丁酸、大豆低聚糖等[2-4]。淡豆豉的生产方式多为天然发酵，参与发酵的菌种包括枯草芽孢杆菌、米曲霉、酵母菌等[5]，其分泌的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等可有效分解大豆中蛋白质、脂肪油、纤维素等，进而产生淡豆豉的药效和特有风味。淡豆豉发酵过程一般分为前酵和后酵（再闷）2 个部分，其中前酵多为常温有氧发酵，传统认为发酵至“黄衣上遍”即可，一般需要4～5 d，后酵则多为高温无氧发酵。目前，研究多以黄酮苷元、γ-氨基丁酸含量等为指标对淡豆豉进行质量控制[6-7]，对淡豆豉前酵过程关注较少，而淡豆豉前酵产物的优劣直接关系到后酵成品的质量。本研究拟对淡豆豉前酵过程中蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶活力，质量损失率、黄酮苷类成分变化进行动态分析，阐明前酵过程中淡豆豉相关酶活力的变化，为控制淡豆豉前酵质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695-empower型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；UV2600型紫外-可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；Centrisart®A-14C 型微量离心机（德国赛多利斯公司）；XS205 型电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；HH-4 型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；HY-2 型往复振荡器（常州澳华仪器有限公司）；T18 Digital 数显型分散机（IKA公司）。

1.2 试药

中性蛋白酶活性检测试剂盒（批号：20201104）、酸性蛋白酶活性检测试剂盒（批号：20201104）、碱性蛋白酶活性检测试剂盒（批号：20201104）均购自北京索莱宝科技有限公司；橄榄油（批号：20201204）、乳酸盐缓冲液（pH=3.0，批号：L05D11G133477）、磷酸盐缓冲液（pH=7.5，批号：L03F12G139378）、硼酸盐缓冲液（pH=10.5，批号：L01N11G129662）均购自上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钾容量分析用溶液（0.050 09 mol·L-1，批号：S4X1）、邻苯二甲酸氢钾缓冲液（pH=4.01，批号：L5X1）均购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；聚乙烯醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：30153160）；甲醇（赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯）；其余试剂均为分析纯。

参考《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版自制淡豆豉前酵样品，发酵温度为26 ℃，相对湿度为75%，发酵至第5 天时外观呈“黄衣上遍”，到达发酵终点。分别在前酵第1、2、3、4、5天取样，45 ℃干燥，即得实验用样品。

2 方法与结果

检测不同前酵时间（1、2、3、4、5 d）淡豆豉中3 种蛋白酶及纤维素酶、脂肪酶活性，黄酮类成分含量变化和质量损失率，每个时间节点平行制备2批样品，每个样品平行检测3次。数学统计均使用SAS 8.2软件。

2.1 酸性、中性、碱性蛋白酶活力测定方法

以中性蛋白酶为代表，建立3 种蛋白酶活力测定方法学。

2.1.1粗酶液的制备 淡豆豉粉碎，过三号筛，取粉末0.5 g，置于50 mL离心管中，加入缓冲液25 mL，摇匀，振荡10 min，取混悬液2 mL，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为4.5 cm），取上清液，即得。其中，乳酸盐缓冲液提供酸性环境，磷酸盐缓冲液提供中性环境，硼酸盐缓冲液提供碱性环境。

2.1.2酶活力测定方法 参照试剂盒说明书及《中华人民共和国国家标准：蛋白酶制剂》（GB/T 23527—2009）[8]确定方法：对照管中加粗酶液100µL，三氯醋酸溶液200µL，测定管中加粗酶液100µL，对应pH的酪蛋白缓冲盐溶液200µL，混匀，30 ℃水浴10 min后，对照管加入对应pH的酪蛋白缓冲盐溶液200µL，测定管加入三氯醋酸溶液200µL，混匀，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为4.5 cm），取上清液。测定管、对照管加对应上清液各200µL，空白管加蒸馏水200 µL，标准管加0.25 µmol·mL-1酪氨酸溶液200µL，4 种离心管中再均加入碳酸氢钠溶液1 mL、福林-酚试剂200 µL，混匀，30 ℃水浴20 min，于680 nm测定吸光度（A）。

按公式（3）计算蛋白酶活力。每克样本每分钟催化水解产生1µmoL酪氨酸为1个酶活单位。

式中C标准品为标准品浓度（µmol·mL-1），W为样本质量（g），V1为酶促反应总体积（mL），V2为加入反应体系中粗酶液体积（mL），V3为粗酶液总体积（mL），T为催化反应时间（min）。

2.1.3标准曲线的制备 取离心管，分别加入蒸馏 水，0.125、0.167、0.200、0.250、0.333、0.500 µmol·mL-1酪氨酸溶液各200µL，按2.1.2 项下方法进行测定，以A为横坐标，酪氨酸物质的量为纵坐标，绘制标准曲线：Y=0.104 0X+0.004 2（r=0.999 3），0.02～0.10µmol呈良好的线性关系。

2.1.4精密度试验 取2.1.3项下0.250µmoL·mL-1标准品连续测定6 次，RSD 为0.142%，说明方法精密度良好。

2.1.5重复性试验 按2.1.1 项下方法制备6 批粗酶液，按2.1.2 项下方法制备样品并检测，酶活力的RSD为3.530%，说明方法重复性较好。

2.1.6稳定性试验 按2.1.1 项下方法制备粗酶液，按2.1.2 项下方法制备样品，分别在0、10、20、30、60、120、180 min 检 测，A的RSD 为4.468%。实验发现，随着待测样品放置时间增加，A不断上升，180 min 后检测得到的A值较最初增加0.44，故认为样品应水浴立刻检测。

2.2 纤维素酶活力测定方法

2.2.1粗酶液的制备 淡豆豉粉碎，过三号筛，取粉末2.0 g，置于50 mL离心管中，加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液25 mL，摇匀，振荡10 min，取混悬液2 mL，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为4.5 cm），取上清液，即得。

2.2.2酶活力测定方法 参照试剂盒说明书所载方法：对照管中加煮沸的粗酶液100µL，测定管中加粗酶液100µL，各加入羧甲基纤维素钠溶液50µL、邻苯二甲酸氢钾缓冲液200 µL，混匀，50 ℃水浴30 min，取出后立即放入沸水中煮沸15 min，得糖化液。对照管、测定管中加入相应的糖化液100µL，各加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液150µL，混匀，沸水浴中煮沸，显色15 min，冷却，加入蒸馏水1000µL，混匀，540 nm处蒸馏水调零，测定A。根据标准曲线计算样本葡萄糖浓度，每克组织在反应体系中每分钟催化产生1µg葡萄糖定义为1个酶活力单位。

按公式（4）计算纤维素酶活力。

式中1000 为单位换算系数，y为样本质量浓度（mg·mL-1），V反总为反应体系总体积（mL），V样为加入样本体积（mL），V样总为加入提取液体积（mL），T为反应时间（min），W为样本质量（g）。

2.2.3标准曲线的制备 取离心管，分别加入蒸馏水，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1葡萄糖溶液各50 µL，按2.2.2 项下方法进行测定，以A为横坐标（X），质量浓度为纵坐标（Y），绘制标准曲线：Y=1.033 9X+0.028 0（r=0.999 7），0.1～1.0 mg·mL-1呈良好的线性关系。

2.2.4精密度试验 取质量浓度为0.45 mg·mL-1标准品连续测定6 次，A的RSD 为0.198%，说明方法精密度良好。

2.2.5重复性试验 按2.2.1 项下方法制备6 批粗酶液，按2.2.2 项方法制备样品并检测，酶活力RSD为2.914%，说明方法重复性较好。

2.2.6稳定性试验 取2.2.4 项下标准品，分别在0、10、20、30、40、50、60 min 检测，A的RSD 为0.486%，说明样品在60 min内稳定性良好。

2.3 脂肪酶活力测定方法

参照《中华人民共和国国家标准：脂肪酶制剂》（GB/T 23535—2009）[9]进行检测，粗酶液制备方法：淡豆豉粉碎，过三号筛，取粉末2.0 g，置于50 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液25 mL，摇匀，振荡10 min，取混悬液2 mL，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为4.5 cm），取上清液，即得。加酶量为2 mL。

2.4 前酵过程质量损失率测定方法

取蒸熟的黑豆300 g，共10 份，分别进行前酵，每天取出2 份，35 ℃干燥，计算质量损失，前酵共5 d。

2.5 前酵过程中黄酮类成分测定方法

使用参考文献[10]中的检测方法。大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的线性范围分别为1.44～72.00、0.410 4～20.520 0、2.88～144.00、1.272～63.600、0.206 6～10.330 0、1.314～65.700 μg·mL-1，加样回收率分别为107.59%、101.17%、99.70%、101.60%、96.08%、101.99%，RSD均小于2%。

2.6 前酵过程中3种蛋白酶活力变化趋势

前酵过程中3种蛋白酶活力变化见图1～2。

图1 淡豆豉前酵过程中3种蛋白酶活力变化（, n=2）

由图1～2可知，酸性蛋白酶活力在前酵第2天即达到最高，但仍远小于其他2 种蛋白酶，后续趋近消失；碱性蛋白酶活力呈先快速增加后平稳的趋势，在前酵4 d 内活力高于其他2 种酶；中性蛋白酶呈稳定增加的趋势，在前酵第5 天时活力超过碱性蛋白酶。

2.7 前酵过程中纤维素酶活力变化趋势

由图3 可知，纤维素酶活力在前酵过程中总体呈升高趋势，仅前酵第3 天时有略微下降，和中性蛋白酶结果趋势接近。同时考虑到纤维素酶耐高温，在后酵过程中也可发挥作用，且其可将黄酮类成分有效转化为黄酮苷元，故认为纤维素酶可以作为淡豆豉前酵过程的一个控制指标。

2.8 前酵过程中脂肪酶活力变化趋势

前酵过程中脂肪酶活力先增加后略微下降，前酵第4天时酶活力达到顶峰（图4）。

图4 淡豆豉前酵过程中脂肪酶活力变化（, n=2）

2.9 前酵过程淡豆豉质量损失率变化趋势

随着前酵时间的增加，淡豆豉质量损失率逐渐升高（图5），说明在微生物作用下，淡豆豉营养成分在被不断分解消耗。

图5 淡豆豉前酵过程质量损失率变化

2.10 前酵过程黄酮类成分变化趋势

前酵过程黄酮类成分变化见图6，其含量已扣除质量损失。

图6 淡豆豉前酵过程中黄酮类成分质量分数变化（, n=2）

《中国药典》2020 年版以大豆素和染料木素作为淡豆豉质量控制指标，规定其总质量分数不得少于0.04%[1]。由图6 可知，在前酵过程中，黄酮苷类成分不断转化为苷元。以大豆苷为例研究前酵过程中黄酮类成分转化损失，大豆苷相对分子质量为416.38，大豆素相对分子质量为254.23。由图6可知，前酵过程中大豆苷的质量分数降低了0.83 mg·g-1，大豆素质量分数应增加0.507 mg·g-1，但实际增加量仅为0.26 mg·g-1，说明前酵过程中微生物会破坏黄酮类成分，提示前酵过程中适度发酵可保留淡豆豉指标成分。

使用SAS 8.2 软件对淡豆豉发酵过程中质量损失率，黄酮苷类成分、黄酮苷元类成分与3 种酶活力的变化进行分析，发现6 组数据均正态，故计算其Pearson 相关系数（r），对相关性显著的数据进行回归分析，计算其直线相关的调整决定系数（R2adj），结果见表1。

表1 前酵过程中其他指标和3种酶活力相关性

可以发现，中性蛋白酶和前酵过程中质量损失、黄酮苷类成分损失相关性强（∣r∣＞0.98），纤维素酶、脂肪酶与其相关性较弱，提示中性蛋白酶可作为前酵过程中的1 个控制指标，其代表了微生物对淡豆豉的分解作用，在生产中可以通过检测中性蛋白酶活力侧面表征发酵程度，以便更好地量化“黄衣上遍”这一传统前酵终点指标。对于黄酮苷元类成分增加量，脂肪酶与其相关性较强，但R2adj仍较低，其原因可能与微生物对黄酮苷的分解有关。

3 讨论与结论

黑曲霉、米曲霉、担子菌和酵母菌等可分泌酸性蛋白酶，米曲霉和芽孢杆菌属微生物可分泌中性蛋白酶，芽孢杆菌属和链霉菌属微生物，可分泌碱性蛋白酶[11]。因此，蛋白酶活力可侧面反映相关菌种的生长情况。从图2 可以发现，酸性蛋白酶活力增长速率前酵2 d后即开始负增长，说明可能此时黑曲霉、酵母菌等生长受到抑制；碱性蛋白酶活力增长速率在前酵第2 天达到顶峰后逐渐降低，说明可能此时枯草芽孢杆菌大量繁殖，也解释了为何淡豆豉前酵过程2～3 d时曲块较黏，翻曲可拉丝；中性蛋白酶活力增长速率始终较为稳定，说明米曲霉等中性蛋白酶相关菌在前酵过程中稳定增长，也符合传统前酵终点“黄衣上遍”，即米曲霉大量繁殖并产生孢子。纤维素酶活力在前酵过程中总体呈升高趋势，仅前酵第3 天时有略微下降，和中性蛋白酶结果趋势接近。同时考虑到纤维素酶耐高温，在后酵过程中也可发挥作用，且其可将黄酮类成分有效转化为黄酮苷元[12]，故认为纤维素酶也可以作为淡豆豉前酵过程的1个控制指标。总体来看，前酵第5天时酶活力增长近停滞，侧面说明此时微生物生长已接近顶峰。

图2 淡豆豉前酵过程中3种蛋白酶活力变化速率

《中华人民共和国国家标准：蛋白酶制剂》（GB/T 23527—2009）[8]中仅对测定方法的精密度和线性进行要求，本研究在试剂盒原有粗酶液提取方法的基础上进行了优化，增加了稳定性、重复性的考察，以更好地适应淡豆豉样品。本研究对粗酶液提取倍量、振荡时间、每个样品平行测定次数等提取条件进行考察，确定了最佳提取条件和检测次数。纤维素酶活性测定过程中增加了对反应温度、反应pH、粗酶液及糖化液加入量的考察，确定最佳提取条件。脂肪酶活力测定中，为减少铜皂法以甲苯为溶剂的实验污染，采用滴定法测定脂肪酶含量。