刘 慧,李 洋*

(1.河南省人民医院，郑州 450000；2.郑州大学人民医院，郑州 450000；3.河南大学人民医院，郑州 450000)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)最新数据，全世界每年新增570000例宫颈癌病例，其中有313000例死亡[1]。近99%的宫颈癌样本可检测到人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)。HPV是一种无包膜双链环状DNA病毒，属于乳头瘤病毒科，由核心单拷贝的病毒基因组DNA及病毒蛋白衣壳构成。目前发现的HPV约有200种型别[2]，分为高危型和低危型，其中高危型HPV(high-risk HPV,HR-HPV)感染被认为是宫颈癌发病机制中最主要的因素[3]。HPV16和HPV18型是目前HR-HPV中公认的致癌力最强的亚型，约70%的宫颈癌病例与其相关[4]。除HPV16/18外，还有许多其他类型的HR-HPV在全世界传播，包括HPV26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82等，这些类型在地理分布上有很大差异。

2020年11月17日WHO再次启动《加速消除宫颈癌全球战略》[1]，呼吁全球194个国家共同致力于在2030年实现：90%的女孩在15岁前完成HPV疫苗接种；70%的女性在35～45岁,接受至少一次高质量的宫颈癌筛查；90%确诊宫颈癌的女性得到治疗。我国国家卫生健康委员会表示将通过疫苗接种、宫颈癌筛查和治疗三级防治路径响应《加速消除宫颈癌全球战略》。本文旨在详细了解河南省女性HPV流行病学特点，并通过归因分析及相对危险度(relative risk,RR)分析评估不同高危或疑似高危型HPV对宫颈病变的致病风险,为制定适合我国国情的宫颈癌筛查策略和HPV疫苗的研究、开发及分配提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源 采用横断面研究，回顾分析2019年1月1日至2020年12月31日在河南省人民医院健康管理科行HPV分型检测及液基薄层细胞学(Thinprep cytologic test,TCT)检测的体检者资料，收集患者的年龄、籍贯、现居住地、婚姻状况、性生活史、HPV分型检测结果、TCT检测结果等信息。纳入标准：有性生活史的河南省女性；同时进行HPV分型检测及TCT检测；数据资料完善。本研究符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 研究方案

1.2.1 标本采集 在非经期进行，取材前24h被检者无性生活及阴道操作。暴露宫颈，使用特制宫颈软毛刷伸入宫颈管内，沿子宫颈顺时针旋转5～6周刷取宫颈口及宫颈管的上皮细胞，将采集到的样本置于保存液瓶。

1.2.2 HPV-DNA分型检测 采用凯普生物化学有限公司生产的37分型核酸检测试剂盒(PCR+膜杂交法)进行检测，采集的宫颈脱落细胞放于保存液中，24h内按DNA分离提取试剂盒说明书进行DNA提取及扩增，并采用核酸分子快速杂交仪及配套试剂盒，按试剂盒说明书进行导流杂交，酶标显色。结果判断：(1)阳性：杂交膜上的Biotin对照显色，同时HPV杂交点也显色，阳性点为蓝紫色圆点；(2)阴性：杂交膜上只有Biotin对照点及内对照点显色。37种HPV亚型包括14种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)、5种疑似高危型HPV(HPV26、53、70、73、82型)和18种低危型HPV(HPV6、11、34、40、42、43、44、54、55、57、61、67、69、71、72、81、83、84型)。

1.2.3 TCT检测 使用ThinPrep2000系统将ThinPrep保存液中的样本制片，固定标本、染色，在镜下观察。诊断结果根据子宫颈细胞学Bethesda报告系统(the Bethesda System,TBS)诊断标准分为：(1)未见上皮内病变细胞或恶性细胞(no intraepithelial lesion cells and malignant,NILM)；(2)鳞状上皮细胞异常：无明确诊断意义的不典型鳞状细胞(atypical squamous cell of undetermined significance,ASCUS)、不能排除高级别鳞状上皮内病变不典型性鳞状细胞(atypical squamous cells-cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion,ASCH)、低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)、鳞状细胞癌；(3)腺上皮细胞改变：不典型腺上皮细胞(atypical glandular cells,AGC)、腺原位癌(adenocarcinoma in situ,AIS)、腺癌；(4)其它恶性肿瘤。将宫颈细胞学病变≥ASCUS界定为TCT阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，采用卡方检验进行组间率的比较，P<0.05为差异有统计学意义。采用比例归因方法计算各型致病HR-HPV及疑似HR-HPV在TCT阳性病例中的归因比例，以评估该型HPV对宫颈细胞学异常的致病贡献。归因系数=每种HPV亚型的单一感染例数÷致病HPV单一感染总例数；归因比例=(每种HPV亚型的单一感染例数+混合感染例数)÷致病HPV总感染例数×归因系数[5-6]。采用RR分析比较特定HPV亚型导致宫颈细胞学及组织病理学异常的风险程度，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同年龄女性HPV感染分布 共纳入10430例女性体检资料，年龄20～92岁，平均(47.44±11.66)岁。HPV总感染率为13.53%，其中20～29岁女性感染率最高，为17.30%；其次是60～65岁女性，为15.21%；年龄在65岁以上女性HPV感染率最低，为11.63%；差异有统计学意义(P=0.041)。HR-HPV、疑似HR-HPV感染率分别为9.18%和1.74%，不同年龄段感染率差异无统计学意义(P>0.05)。低危型HPV感染率为4.30%，其中60～65岁女性感染率最高，为5.62%；其次是20～29岁女性，为5.51%；30～39岁女性最低，为3.28%，差异有统计学意义(P=0.018)。见表1。

表1 不同年龄女性HPV感染分布

2.2 HR-HPV及疑似HR-HPV感染的流行病学分析 HPV-DNA检测试剂共检测到37种HPV亚型，其中19种属于低危型HPV，此处不再讨论。10430例体检样本中，HR-HPV及疑似HR-HPV的总感染率为10.44%(n=1089)，其中最流行的亚型是HPV52，在227例样本中可检测到，感染率为2.18%；其次为HPV58、16、53、39，HPV18感染率相对较低。HR-HPV及疑似HR-HPV的单一感染率为8.59%(n=896)，双重感染率为1.51%(n=157)，多重感染率为0.35%(n=36)；单一感染、双重感染、总感染在20～29岁女性分布最广，感染率分别为9.89%、2.66%、13.12%；在年龄>65岁的女性中分布最低，感染率分别为7.47%、1.22%、9.72%，但>65岁的女性多重感染在各年龄中分布最广，感染率为1.04%；在30～39岁女性中分布最少，感染率分别为0.21%。见表2、图1。

表2 不同年龄女性HR-HPV及疑似HR-HPV感染分布

图1 不同年龄女性HR-HPV及疑似HR-HPV单一、双重及多重感染分布

2.3 TCT阳性病例中致病HR-HPV及疑似HR-HPV的归因分析 10430例体检样本中，TCT阳性样本191例(1.83%)，包括ASC-US 155例、ASC-H 8例、LSIL 22例、HSIL 6例。其中合并HR-HPV或疑似HR-HPV感染者82例(42.93%)。采用比例归因方法对191例TCT阳性样本中的致病HR-HPV及疑似HR-HPV亚型进行归因分析，致病HPV共包含13种，分别是HPV16、31、33、39、51、52、53、56、58、59、66、68、53。结果显示，归因比例最大的HPV亚型是HPV52(5.62%)，提示HPV52对宫颈细胞学异常有最大的致病贡献，是最主要的致病亚型；其次为HPV16、58、56、53、39、51、31、33、73、66、68、59。见图2。值得注意的是，6例HSIL病例中4例致病HPV为HPV58单一感染，1例HPV16单一感染，1例为HPV58及HPV16双重感染，提示HPV58与HSIL关系密切，但由于样本量较小，不再行统计学分析。

对于以上归因比例较大的6种HPV，进一步分析其相较于其它HR及疑似HR-HPV对TCT阳性的相对危险度，HR及疑似HR-HPV阳性病例共1089例，TCT阳性病例共191例。结果显示，与其他HR及疑似HR-HPV相比，HPV16[RR(95%CI)=1.792(1.098～2.923)]及HPV56[RR(95%CI)=3.800(2.190～0.593)]对TCT阳性有更高的致病风险，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

图2 致病HR-HPV及疑似HR-HPV对TCT阳性的归因分析

表3 特定HPV亚型对TCT阳性的相对危险度(RR)分析及卡方检验

2.4 常见HR-HPV及疑似HR-HPV对组织病理学异常的相对危险度分析 HPV16或18阳性者、ASC合并HR/疑似HR-HPV感染者、宫颈病变级别≥LSIL者需进一步转诊阴道镜检查及宫颈组织活检。我们对符合上述条件的病例进行了追踪，纳入了有准确病理结果及宫颈病变分级的病例。未行阴道镜检查及宫颈活检者或检查时间距TCT/HPV检查时间超过1年者、因未行免疫组化无明确组织病理学结论者均被排除在外。共纳入58例病例，其中宫颈病变级别≥原位癌者5例，HSIL15例，LSIL17例，炎性病变或息肉共21例；高危型HPV感染情况：HPV16阳性30例，HPV18阳性10例，HPV52阳性10例，HPV58阳性6例，HPV51阳性4例，HPV39阳性3例，HPV59阳性2例，HPV31阳性2，HPV56/66/68/35阳性各1例；疑似HR-HPV53阳性5例；低危型HPV34/54/61/71各1例。

进一步分析结果2.2中流行性最广的5种HPV以及结果2.3中对TCT阳性致病贡献最大的5种HPV导致组织病理学异常(病理分级≥LSIL)的相对危险度。结果显示，相对危险度HPV56(RR=1.583)>HPV58(RR=1.354)>HPV52(RR=1.324)>HPV16(RR=0.985)，差异无统计学意义(P>0.05)，但相较于HPV16，HPV56、58、52导致宫颈病变的危险度呈上升趋势。见表4。

表4 特定HPV亚型对组织病理学异常的相对危险度(RR)分析及卡方检验

3 讨 论

宫颈癌是一个重要的公共卫生问题，2018年宫颈癌发病率和死亡率的全球分析显示,中国宫颈癌病例超过10万例，死亡病例约4.8万例[7]。已知持续HR-HPV感染是宫颈癌发生的必要条件，HPV检测成为了宫颈癌早期筛查的重要手段。HPV亚型较多，分布较广，不同国家和地区HPV分布特点明显不同，HPV的流行病学调查对于宫颈癌的防治至关重要。本文通过回顾分析10430例宫颈癌筛查数据，总结了37种HPV亚型的年龄分布特点及19种HR/疑似HR-HPV的流行病学特点，并对导致宫颈细胞学及组织病理学异常的HR/疑似HR-HPV进行归因分析和相对危险度分析。

3.1 HPV感染率及年龄分布特征 本研究数据显示，2019年1月1日至2020年12月31日期间河南省女性HPV感染率为13.53%，其中HR/疑似HR-HPV的感染率为10.44%，与福建省福清地区、新疆石河子城区、苏州、福州等地报道的感染率相近[8-11]。不同年龄段的HPV感染率具有明显差异，总体呈双峰分布，在20～29岁女性中最高，其次是60～65岁女性；低危型HPV感染率在60～65岁女性感染率最高，其次是20～29岁女性；这与之前的研究结论相似[12-13]。形成这种差异的原因可能是小于30岁的女性性生活较为活跃，而60～65岁的女性由于性激素长期处于低水平状态，阴道黏膜萎缩、阴道菌群失调且普遍免疫力较低，使得HPV易感性增加[14]。此外，研究结果显示HR-HPV及疑似HR-HPV多重感染在年龄>65岁的女性中分布最广，推测可能原因一方面是由于老年女性阴道屏障减弱、HPV易感性增加且免疫系统清除能力较低所致；另一方面，老年女性阴道黏膜菲薄，行妇科检查时会有明显不适感，因此行宫颈癌筛查的参与率较低、间隔周期较长，多重感染的检出率增加。

3.2 HR-HPV和疑似HR-HPV感染的流行病学分析 本研究结果显示，河南省最常见的5种HR/疑似HR-HPV亚型是HPV52、HPV58、HPV16、HPV53及HPV39，HPV18的感染率相对较低。这与中国其它城市的结论相似，又存在一些差异。如深圳市最常见的5种HR-HPV亚型是HPV52、HPV58、HPV16、HPV51、HPV53[15]；四川省最常见的5种亚型是HPV52、HPV53、HPV58、HPV16、HPV56[16]；云南省最常见的5种亚型HPV16、HPV33、HPV52、HPV58、HPV3[17]；福建省最常见的5种HR-HPV亚型是是HPV16、HPV52、HPV58、HPV18、HPV53[12]；广东省最常见的5种HR-HPV亚型是HPV16、HPV52、HPV58、HPV18、HPV8[18]。综合以上多个地区的HPV流行病学结果可以看出，相比HPV16和HPV18，我国HR-HPV感染中HPV52和HPV58更常见。目前，HPV疫苗在国内逐步使用，经我国食品药品管理局批准的HPV疫苗有4种：中国二价HPV疫苗(馨可宁)、英国二价HPV疫苗(Cervarix)，美国四价(Gardasil-4/Silgard)和九价(Gardasil-9)HPV疫苗[19]。二价HPV疫苗可预防的HPV亚型仅包括HPV16和HPV18，四价HPV疫苗可预防的HPV亚型包括高危型HPV16/18和低危型HPV6/11，九价HPV疫苗可预防的HPV亚型包括高危型HPV16/18/31/33/45/52/58和低危型HPV6/11。目前国产预防性HPV疫苗是二价疫苗，结合当下HPV在我国的流行现状，未来疫苗的研制应重视HPV52/58等亚型的防治，研发覆盖更多HR-HPV亚型的新型疫苗更符合中国女性的需求。

3.3 与其他HR-HPV或疑似HR-HPV相比，HPV16及HPV56似乎对宫颈细胞学异常有更高的致病风险 本研究数据中，TCT阳性的病例为191例，阳性率为1.83%，与孟彬[20]、卫银娟[21]、张北华等[22]的研究报道相似，TCT阳性率分别为1.84%、1.83%和1.98%；但明显低于之前的一些临床报道[23-25]。造成这种差异的原因可能有以下两点：(1)本研究纳入的研究对象是健康体检人群，而临床研究中的对象多为门诊患者，门诊患者相比健康体检者HPV既往感染者、伴有症状者较多，故表现出更高的TCT阳性率。而孟彬[20]、卫银娟[21]、张北华等[22]的研究对象同样为体检人群，因此TCT阳性率与本结果相近；(2)本研究纳入的研究对象年龄范围更广，涵盖了20～92岁的女性，而其它研究纳入人群年龄普遍低于65岁，本数据中65岁以上女性TCT阳性率仅为1.042%，远远低于研究队列的总感染率及平均感染率。

对TCT阳性病例中各型致病HR-HPV及疑似HR-HPV的归因分析显示，对TCT阳性致病贡献最大的是HPV52，提示HPV52是宫颈细胞学异常最主要的致病亚型，随后依次是HPV16、HPV58、HPV56、HPV53、HPV39等。这一结论与张磊等[26]对CIN和宫颈癌患者的HPV亚型归因分析结果一致。其中，6例HSIL病例中5例均有HPV58感染，提示HPV58是HSIL最主要的致病亚型。宋妮娜[27]研究报道，HPV52和58型与HSIL的发生具有相关性，临床应引起重视。王文鹏等[5]、Chan等[6]对不同病理类型宫颈癌的归因分析中也认为HPV52和58是常见的致癌亚型。然而，本研究进一步对比了归因分析中致病贡献最大的6种HPV对TCT阳性的相对危险度，发现相较其它HR/疑似HR-HPV亚型，HPV16及HPV56对TCT阳性有更高的致病风险(P<0.05)，而HPV58和HPV52与其它相比则无统计学差异。这一结果表明HPV52、HPV58对宫颈细胞学异常的致病贡献主要来源于较高的感染率。

3.4 与HPV16相比，HPV56、HPV58及HPV52导致宫颈病变的危险度呈上升趋势 为增加研究的完整性，本研究对需要转诊阴道镜检查及宫颈组织活检的病例进行了追踪，纳入了有准确病理结果的病例58例。进一步分析了HR/疑似HR-HPV中流行性较广或对TCT阳性致病贡献较大的共6种HPV导致宫颈病变(组织病理学分级≥LSIL)的相对危险度。结果显示，与HPV16相比，HPV56、HPV58、HPV52导致宫颈病变的危险度呈上升趋势，这提示在临床工作中，除HPV16和18外，HPV56/58/52感染者可能也应考虑阴道镜转诊。但这一结果差异无统计学意义，可能是由于样本量较小所致。目前关于其它HR-HPV致癌力的相关研究较少，尚未形成统一认知。Wang等[23]研究报道，HPV 16/18/31/33/52/58感染者经阴道镜转诊后HSIL的检出率较高；Sung等[28]研究结论也表明，对于HPV52/58感染者，可能需要采取更积极的行动。但以上两项研究样本量较小，仍需更大规模的临床试验或队列研究验证这一结论。

本研究优势在于：(1)样本量大，且研究对象是普通体检人群，研究结论更具有普适性；(2)除TCT和HPV结果外，还追踪了组织病理学结果，使研究更具完整性；(3)数据分析更加全面，采用了归因分析及相对危险度分析，研究结论更具有客观性及可信度。本研究的限制性在于TCT阳性病例和追踪到的组织病理学数据样本量较小，可能导致数据偏倚。

综上所述，中国河南省最常见的5种HPV亚型是HPV52、HPV58、HPV16、HPV53、HPV39，其中HPV52是TCT阳性最主要的致病亚型，HPV58是HSIL最主要的致病亚型。相较其它HR及疑似HR-HPV，HPV16和HPV56对宫颈细胞学异常有更高的致病风险。与HPV16相比，HPV56、HPV58及HPV52导致宫颈病变的危险度呈上升趋势。提醒我们，中国的宫颈癌筛查策略、阴道转诊及未来HPV疫苗的研制对HPV56/58/52感染应采取更加积极的行动。但由于本研究中组织病理学样本量较小，仍需更大规模的临床试验或队列研究验证这一结论。