李 辰 张天锋 闻 愚 王云龙 包武阳

（南阳医学高等专科学校第一附属医院普外1科，南阳 473058）

结肠癌（colon cancer，CC）是常见的消化道恶性肿瘤，发病率和致死率极高，早期不易被发现，晚期无特效治疗药物，严重威胁人类生命健康［1］。神经纤毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）是血管内皮生长因子家族成员的共同受体，对肿瘤血管新生、肿瘤生长及转移性传播具有重要作用。研究表明，NRP1在肺癌、胰腺癌、CC等多种癌症中高表达［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是由一段长度为20～24个碱基组成的内源性非编码小RNA，可与靶向基因的3"UTR区域配对结合，抑制目标mRNA和蛋白表达，参与靶向基因表达的调控［3］。研究表明，miRNA具有多种生物学功能，在肿瘤增殖和转移过程中发挥重要作用，可作为肿瘤治疗的潜在靶点［4-5］。miR-212是miRNA中的一员，定位于人17号染色体，在肺癌细胞、骨髓瘤细胞、结直肠癌细胞等多种肿瘤细胞中发挥调控作用［6-7］。但miR-212在CC中的研究鲜见报道，因此，本文通过RT-PCR检测miR-212在SW480细胞中的表达水平，利用生物信息学手段预测miR-212的靶基因NRP1，并以荧光素酶实验进行验证，检测miR-212对NRP1表达水平的影响，初步阐明miR-212调控CC SW480肿瘤干细胞样特性和免疫应答的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人CC细胞SW480购自中国科学院细胞库。胎牛血清（FBS）、胰酶和RPMI1640培养基购自美 国Gibco公 司；miR-212-5p、miR-NC、pcDNANRP1购自美国Ambion公司；Trizol试剂和转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及实时定量PCR荧光染料Sybergreen购自TaKaRa生物有限公司；荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；一抗、二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将细胞转移至无菌离心管，加入含10%FBS的RPMI1640培养基，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞培养液悬浮细胞，接种至细胞培养板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。……