谢楠茜 张亚星 李甜甜 刘 丹 郑月娟（上海中医药大学基础医学院中医药免疫中心，上海 201203）

脓毒症是一种机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍［1］。主要由感染引起的伴随有全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的一种危重疾病，病死率高达30%～70%［2］。其主要病机是感染的清除障碍引发免疫失调，系统性炎症反应和凝血功能障碍，最终导致多器官功能衰竭，甚至休克［3］。在脓毒症早期，局部感染不能被有效控制导致固有免疫细胞的过度活化，从而引发“细胞因子风暴”，导致SIRS。脓毒症晚期，大量免疫细胞由于早期的过度活化而损伤或死亡，引发免疫功能低下和持续的免疫抑制，从而造成脓毒症的复发或者继发感染［4］。脓毒症的高发病率和高病死率一直是医学界面临的巨大挑战，主流治疗包括抗感染和支持治疗，尚无特异性的治疗方案［5］。

脓毒症患者的免疫功能状态与脓毒症的发生、发展和预后密切相关，免疫调节治疗成为研究的一个热点。在脓毒症中，中性粒细胞参与抗感染、炎症诱导和组织病理损伤，同时也存在中性粒细胞的功能障碍和迁移功能异常。在最初的炎症反应中，脓毒症引起的全身炎症性反应导致了中性粒细胞的过度产生和过度反应；然而未消退的炎症将导致中性粒细胞发挥抗炎作用，促使脓毒症患者进入免疫抑制状态；此时存在中性粒细胞的数量和功能不足，又可能造成脓毒症的复发及院内继发感染，患者的病死率将大幅度提高［3］。本文综述了在脓毒症中，中性粒细胞的数量、半衰期、抑制性细胞类群、生物学行为及其功能，并探讨中性粒细胞作为治疗靶点的研究现状和应用前景。

1 脓毒症时中性粒细胞数量、半衰期的改变

中性粒细胞是一种多形核白细胞，是人类免疫系统中最丰富的循环白细胞群，占健康成人所有循环白细胞的50%～70%［6］。其在感知和清除细菌和真菌等微生物方面具有很高的效力。中性粒细胞减少症患者更易发生微生物感染［7］。

1.1 数量增加通常认为中性粒细胞起源于骨髓内共同髓系祖细胞（common myeloid progenitor，CMP），但最近研究发现其起源于淋巴预处理的多潜能祖细胞（lymphoid-primed multipotent progenitor，LMPP），LMPP由造血干细胞分化而来，可以进一步分化为粒细胞-单核细胞前体（granulocyte-monocyte progenitor cell，GMP），继而经历原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、带状中性粒细胞等分化阶段，最终发育为成熟的中性粒细胞［8］。

中性粒细胞是最早从血液中迁移到感染和炎症部位的吞噬细胞，具有数量多、更新快、寿命短的特点。成人骨髓每天可产生（1～2）×1011个中性粒细胞。当细菌感染，骨髓受到炎症因子刺激时，可增至1×1012个以补充其在循环中的数量，其中包含大量的未成熟中性粒细胞［9］。成熟的中性粒细胞表面标志为CD11b+Ly6G+CXCR2+CD101+，而不成熟的中性粒细胞不表达CXCR2和CD101［10］。因此，计算血液循环中不成熟中性粒细胞与中性粒细胞总数的比例可以作为SIRS的诊断参考。

在正常情况下，中性粒细胞在骨髓内的迁移取决于滞留信号和释放信号的平衡，分别由趋化因子受体CXCR4与配体CXCL12以及CXCR2与配体CXCL1/2这两对分子介导的，最终仅有一小部分成熟的中性粒细胞释放到血液中［11］。CXCR4/CXCL12和VLA-4/VCAM-1信号途径对于中性粒细胞在骨髓内滞留起关键作用，当这些分子表达下调，可以促使中性粒细胞从骨髓内释放。CXCR2对于中性粒细胞释放起作用，其配体包括趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL6。故CXCR4/CXCL12和CXCR2/CXCL1/2两个信号分子对的拮抗作用共同决定了中性粒细胞从骨髓向血循环的迁移比例。血循环中衰老的中性粒细胞也可通过上调CXCR4和CCR5以及下调CXCR2和CD62L表达，而归巢于骨髓，从而被骨髓内巨噬细胞清除［12］。中性粒细胞滞留和释放的稳定有助于维持骨髓中中性粒细胞的数量，以应对突发的感染状况。

脓毒症患者往往表现为外周血中性粒细胞的大量和快速增加，而释放入外周中性粒细胞增多可导致骨髓内中性粒细胞储存池耗竭，使未成熟细胞释放入血。未成熟中性粒细胞的识别、吞噬能力低下，不能有效清除病原体；其变形性差，更易在毛细血管内积聚，引起血管闭塞、组织缺氧，造成器官损伤［13］。

在脓毒症时，促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和细菌产物可以促进粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）的 表达，促进中性粒细胞的分化和成熟。此外，在脓毒症中，骨髓内CXCL12的表达下调，CXCL1升高，从而促使中性粒细胞释放到血液中［14］。G-CSF可诱导CD34+粒系祖细胞增殖分化，也可通过抑制CXCR4/CXCL12信号轴来促进成熟中性粒细胞从骨髓迁出。

1.2 凋亡减少、半衰期延长在稳态条件下，人和小鼠的中性粒细胞在血流中的半衰期为6～12 h，然后进入脾脏、淋巴结、肝脏或骨髓组织中，停留1～2 d执行吞噬和杀伤功能，最终经历自发凋亡，被单核/吞噬细胞清除［15-16］。中性粒细胞表达抗凋亡蛋白Mcl-1（myeloid cell leukaemia-1）抑制中性粒细胞凋亡。在严重脓毒症患者中，Mcl-1显著增加，抑制中性粒细胞凋亡，促进其寿命增加了几倍［17］。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和补体5a（component 5a，C5a）可延长中性粒细胞的寿命［3］。涉及如下信号通路，LPS和C5a激活中性粒细胞胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3 kinases，PI3K）和下游Akt通路，促进下游的抗凋亡蛋白Bad磷酸化，从而抑制细胞色素C从线粒体释放，减少凋亡。C5a还能增强抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达，降低促凋亡蛋白Bim的表达。此外，LPS可抑制髓核分化抗原（myeloid nuclear differentiation antigen，MNDA）迁移和裂解，从而阻止Mcl-1被蛋白酶体降解。中性粒细胞的寿命延长可使其在组织中进行更复杂的活动，如有助于炎症的消除或引发适应性免疫应答，但其在组织中的持续存在也可导致组织器官的损伤［18］。

2 中性粒细胞的异质性与脓毒症

循环中的中性粒细胞具有相对较低的转录活性和短寿命的特点，因此一直被认为是终末分化的细胞，具有保守表型和功能的同质群体。但最近通过功能表型分析，发现中性粒细胞在慢性炎症和肿瘤中也存在异质性［19］。异质的中性粒细胞表型的概念最初是由GALLIN提出。随后，许多研究证实在炎症状态下，存在不同中性粒细胞亚群，其具有免疫激活或免疫抑制等不同的作用［20］。

中性粒细胞的异质性和可塑性主要体现在细胞核形态、细胞密度、中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）释放与否及受体表达等特征方面［21］。中性粒细胞亚群的改变情况，可能用于炎症的风险评估。

2.1 低密度中性粒细胞（low density neutrophil，LDN）中性粒细胞通常是通过密度梯度离心的方法从外周血中分离出来的。绝大多数中性粒细胞比淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque）比重大，被称为正常密度中性粒细胞（normal density neutrophil，NDN）；而轻于该分离液的细胞，被称为LDN，NDN通常包括终末分化的和不成熟的中性粒细胞。在稳定状态下，终末分化的中性粒细胞处于静止状态。系统性炎症促进中性粒细胞新生，也促进不成熟中性粒细胞迁移入血，这个现象称为紧急粒细胞生成［22］。这些不成熟中性粒细胞多为晚幼粒细胞或带状中性粒细胞，其密度被认为与成熟中性粒细胞相似。因此，大多在紧急粒细胞生成状态下迁移入血的不成熟粒细胞属于NDN，少数属于LDN［23］。有意思的是，LDN中存在一个具有免疫抑制功能的亚群，在实体肿瘤、恶性血液病、HIV感染和脓毒症等多种疾病中可以发现这个抑制性LDN亚群的增加［24］。该亚群可以抑制T细胞增殖和IFN-γ产生，被定义为免疫抑制性LDN，也因其不成熟表型被认为是粒细胞样-髓源抑制细胞（granulocytic-myeloid derived suppressor cells，G-MDSC），但还没有证据表明G-MDSC等同于这群LDN［25］。LDN中还有促炎性LDN亚群（pro-inflammatory LDN），在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等重症自身免疫病中被发现［26］。故根据细胞密度，中性粒细胞可分为LDN和NDN。

LDN在脓毒症的免疫抑制阶段起关键的作用。在脓毒症患者中，G-MDSC中包括低密度粒细胞群（low density granulocyte，LDG），通过精氨酸酶依赖机制抑制T细胞功能，增加患者院内感染的风险［27］。

2.2 CD16brightCD62Ldim中性粒细胞 在稳定状态下，血循环中的成熟中性粒细胞通常呈现CD16brightCD62Lbright的表型，其细胞核呈分叶核形态；创伤早期可导致大量的不成熟中性粒细胞迅速进入外周血循环，其为CD16dimCD62Lbright表型，细胞核呈带状；几天后CD16brightCD62Ldim中性粒细胞可以被检测到，其细胞核呈现高度分叶状态［28］。

在系统性炎症中，CD16brightCD62Ldim中性粒细胞被发现具有免疫抑制表型。PILLAY等［29］的研究发现，经LPS刺激，健康人群外周血循环中CD16bright和CD16dim中性粒细胞都明显升高，CD16bright和CD16dim中性粒细胞分别呈现分叶核和带状核形态，其中CD16dim中性粒细胞的抗菌功能减弱。进一步鉴定发现了一个新的具有免疫抑制活性的成熟亚群，其表面标记为CD16brightCD62Ldim，这群细胞能够释放活性氧化合物（reactive oxygen species，ROS）并抑制T细胞增殖［30］。也能通过ROS抑制浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞的功能。IFN-γ可刺激中性粒细胞表达程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制淋巴细胞增殖，参与SIRS［31］。在给予健康志愿者低剂量内毒素诱导的人内毒素血症模型中，成熟的CD16brightCD62Ldim中性粒细胞同样可以抑制T细胞增殖［30］。

多个研究报道，脓毒症患者体内的G-MDSC水平升高，G-MDSC由未成熟和成熟的粒细胞组成，以ROS和精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）依赖的方式抑制T细胞增殖和活化［32］。UHEL等［27］也发现，脓毒症患者外周血中CD14-CD15+低密度G-MDSC、Arg-1和S100A12的表达显著升高，与脓毒症患者增加的院内感染风险相关。DEMARET等［33］也发现，在脓毒性休克的患者中，未成熟CD10dimCD16dim中性粒细胞比例升高，与死亡率增加有关。在脓毒症中，分泌抑炎症细胞因子IL-10的抑制性中性粒细胞亚群可以被诱导表达。

中性粒细胞亚群也可能只是中性粒细胞在病理状态下的生物学表型改变的反映，因此，中性粒细胞是否具有异质性还需要更仔细地评价。

3 脓毒症时中性粒细胞移行异常

中性粒细胞的移行体现在中性粒细胞离开骨髓释放入血，以及从血液向感染部位的趋化和募集。涉及中性粒细胞在血管内皮细胞表面的滚动、黏附、细胞变形、跨内皮细胞移行、释放和募集等过程，受到趋化因子及其受体以及黏附分子表达的调控。中性粒细胞的移行对于感染清除和脓毒症的发展进程和预后都十分重要。在脓毒症早期，过多的迁移可导致炎症加剧；在系统性炎症期间，由于中性粒细胞被招募并迁移到外周组织中，因此越来越多未成熟的中性粒细胞从骨髓中释放，以补充循环粒细胞池；在后期则迁移行为异常可导致局部中性粒细胞数量的减少和免疫功能抑制，使得感染不能控制，进而加剧脓毒症的发展。

中性粒细胞具有活跃的变形运动能力。在血管内迁移过程中，中性粒细胞通过滚动、黏附和爬行而黏附到血管内皮细胞。中性粒细胞表达的黏附分子受体与内皮细胞上相应配体的相互作用使得循环中性粒细胞牢固黏附于血管的管腔表面。在到达合适的外渗部位后，中性粒细胞通过侵入、血管周围嵌入和爬行、突出等方式穿过内皮细胞、周细胞和基底膜，之后，中性粒细胞开始间质迁移［34］。中性粒细胞迁移是重症脓毒症病原体清除的关键。

3.1 黏附和滚动的改变和细胞僵化（rigid）中性粒细胞的起始黏附和滚动是中性粒细胞迁移至炎症部位的始动阶段，也是脓毒症炎症反应的一个关键步骤，在此过程中需要细胞变形。机体感染时，细菌来源的LPS等物质可刺激机体产生炎症因子TNF-α、IL-1β等，诱导炎症部位血管内皮细胞表达P-选择素、E-选择素，与中性粒细胞表面P-选择素配体、E-选择素配体和L-选择素低亲和力结合，介导起始黏附；在趋化因子及其受体的相互作用下，诱导滚动，并促进中性粒细胞的β2整合素淋巴细胞功能相关抗原1（1ymphocyte function associated antigen 1，LFA-1）和巨噬细胞分化抗原1（macrophage-1 antigen，MAC-1）活化聚集，与炎症诱导表达的内皮细胞上的相应配体细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和ICAM-2结合，诱导中性粒细胞滚动停止和与内皮细胞间的稳定黏附。

脓毒症引起的中性粒细胞和内皮细胞黏附分子表达谱的改变进一步促进了中性粒细胞在血管系统中的牢固黏附。脓毒症时，细菌产物和炎性因子刺激中性粒细胞的L-选择素脱落，表达β-整合素，并促进肺微血管内皮表面黏附分子ICAM-1、血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）暴露，二者结合，促进中性粒细胞与内皮细胞的高亲和力结合，导致细胞起始黏附和滚动能力下降，并进一步诱导细胞变形能力下降和细胞僵化。

脓毒症时，促炎因子和细菌产物可促进过氧化物酶体增殖体激活受体γ（peroxisome proliferatorsactivated receptorγ，PPARγ）激活，导致中性粒细胞膜下变形性相关的F-肌动蛋白的累积，中性粒细胞僵化，变形性降低，滚动减少，黏附性增强，从而导致中性粒细胞迁移的始动阶段受阻碍。细胞僵化与脓毒症的严重程度密切相关，导致中性粒细胞在毛细血管床中积聚，特别是积聚在肺和肝血窦的毛细血管，进而导致微血管闭塞，组织缺血继而发生多器官衰竭［10］。脓毒症可引起肺脏血管内中性粒细胞增多和肺部损伤。

3.2 跨细胞迁移的改变中性粒细胞迁移过程包括其通过血管内皮细胞间的紧密连接进入感染部位的过程。此过程需要趋化因子如甲酰-甲硫基-亮氨酰-苯丙氨（formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP）、白三烯B4、IL-8等与趋化因子受体结合。人和动物研究均表明，在重症脓毒症中，尽管感染局部有大量趋化因子存在，但中性粒细胞向感染部位的迁移仍然不充分。趋化因子受体CXCR2表达上调和CCR2表达下调以及PPARγ的上调都参与介导中性粒细胞迁移的异常［3］。

在重症脓毒症患者和动物模型中，均存在中性粒细胞趋化因子受体CXCR2表达下调，及其对趋化因子的应答能力下降。其机制涉及：①反复长期的趋化因子和配体刺激导致中性粒细胞的G-蛋白偶联受体激活，并募集G-蛋白偶联受体激酶（GPCR kinase，GRK）到细胞膜上，诱导G-蛋白偶联受体磷酸化，导致趋化因子受体失去敏感性；②细菌的磷壁酸、LPS和非甲基化CpG寡核苷酸激活中性粒细胞的TLR 2、4、9通路，上调GRK2表达，诱导CXCR2内化；③NO及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与中性粒细胞迁移受损呈正相关。增强的中性粒细胞一氧化氮（nitric oxide，NO）反应启动可溶性鸟苷基环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）激活，环化核苷酸形成和蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）磷酸化，诱导GRK2表达，促进CXCR2内化；④磷酸肌醇三激酶γ（PI3Kγ）信号可负调节CXCR2的内化。中性粒细胞内PPARγ产生也可以NO和ERK1/2依赖的方式负调节中性粒细胞迁移［3］。

脓毒症患者中性粒细胞中CCR2呈高表达，且CCL2趋化能力增高，CCR2的表达水平与病情严重程度呈正相关。病原体及其产物激活TLR2信号通路，通过MyD88/NF-κB途径上调CCR2的表达，促进中性粒细胞迁移至非炎症部位，引起器官损伤。CCR2敲除可以提高脓毒症小鼠的存活率。

4 中性粒细胞的功能改变与脓毒症

在脓毒症中，中性粒细胞被系统性地激活，并迅速迁移到炎症或损伤区域，通过许多不同的机制，包括趋化作用、吞噬作用、ROS释放、颗粒酶和细胞因子的产生和释放以及形成NET来接触和杀死微生物，并通过与其他免疫细胞（如淋巴细胞和抗原呈递细胞）相互作用调节免疫反应［35］。同时，中性粒细胞也是急性炎症过程中导致组织损伤的重要效应细胞［36］。在严重脓毒症患者中，不仅在功能衰竭的器官中发现大量的中性粒细胞，而且该中性粒细胞群的功能也发生了显著改变，功能障碍程度与脓毒症的严重程度呈正相关［37］。

4.1 中性粒细胞呼吸爆发及脱颗粒杀菌机制中性粒细胞是参与宿主抵抗的重要吞噬细胞，通过氧依赖和非氧依赖机制清除被吞噬的病原体。氧依赖机制主要是中性粒细胞受到刺激后，在吞噬体膜上组装成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶复合体，产生大量的超氧阴离子和ROS，这些分子可以与细菌细胞膜、核酸和蛋白质发生氧化还原反应，能够有效杀伤入侵的病原体。此外，ROS可以通过上调细胞因子及黏附分子的表达水平，放大炎症效应，参与形成细胞因子风暴。在该过程中，中性粒细胞耗氧量激增，达到正常消耗量的2～20倍，称为呼吸爆发。非氧依赖机制主要是通过中性粒细胞内胞浆颗粒介导。中性粒细胞有4种胞浆颗粒：嗜天青颗粒、特异性颗粒、三级颗粒和分泌小泡。这些胞浆颗粒含有丰富的酶类物质和杀菌物质，包括髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丝氨酸蛋白酶（neutrophil serine protease，NSP）、组织蛋白酶G（cathepsin G，CG）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和其他杀菌物质等对病原体起到杀伤作用［24］。这些杀菌机制是抵御微生物入侵的有效手段，在炎症过程中发挥了有效的作用。

脓毒症中，过度激活的中性粒细胞浸润聚集在重要器官中，通过呼吸爆发产生大量的ROS，以及脱颗粒作用释放杀菌物质，直接或间接造成重要组织器官损伤。呼吸爆发产生的大量氧自由基促使线粒体的跨膜物质转运系统功能紊乱，最主要的是形成钙超载。钙离子（Ca2+）是体内重要的第二信使，参与细胞的兴奋-收缩耦联。钙超载破坏了细胞内外Ca2+浓度的稳态，致使线粒体内Ca2+大量聚积，使细胞无法维持正常功能，从而导致线粒体、细胞、组织功能障碍。大量促炎症性因子和宿主自身的抗炎因子释放诱导产生ROS，导致体内氧化-还原状态失衡，引起氧化性应激反应，最终伤及组织器官。氧化应激损伤机制是病原体及其毒素激活的过度的炎症反应和持续释放大量的炎症介质，共同影响线粒体内氧化呼吸链的耦联过程，造成ROS生成增多，从而损伤全身血管内皮细胞功能，增加血管通透性，破坏线粒体功能，最终导致脓毒症患者各器官和系统功能障碍。

4.2 中性粒细胞胞外诱捕网（NET）中性粒细胞可以通过产生NET捕获和清除未被吞噬的病原体。NET的形成过程被称作中性粒细胞胞外诱捕网凋零（NETosis），是一种程序性死亡方式。NET又被称为中性粒细胞胞外陷阱，是一种以DNA为骨架，镶嵌了组蛋白胞浆颗粒来源的酶和抗微生物肽等的大分子的网状物［38］。NET可被多种因素诱导形成，如PAMP、细胞因子IL-6、IL-8、自噬小体、抗原抗体复合物和血小板等。当中性粒细胞受刺激活化后，细胞变平坦并附着于基质上，随后细胞核染色质逐渐去浓缩变得疏松，分叶核消失，核膜与胞浆内的颗粒膜融合，颗粒内蛋白与疏松的染色质混合，最后激活消皮素D（gasdermin D，GSDMD）蛋白，介导细胞膜破裂，附着有颗粒源性蛋白的染色质纤维释放到细胞外，形成了NET。目前认为，NETosis有自杀性NETosis（suicidal NETosis）与存活的NETosis（vital NETosis）两种主要形式。前者，细胞被裂解，解聚的染色质构成的NET被释放到细胞外；后者则保持细胞完整性，线粒体DNA构成的NET以出芽方式释放［39］。NET在炎症部位大量产生，其储存了广谱、大量、高效的抗菌物质，捕获并杀死各种病原体，防止扩散。

脓毒症早期，NET可以形成物理屏障，利于病原体的捕获和清除，阻止其扩散，从而抑制脓毒症的进程。随着病情进展，NET可能导致组织损伤、自身免疫加强以及血管血栓的形成。败血症患者常发生急性肺损伤，从患者血浆检测出丰富的NET，提示其与脓毒症严重程度及病死率相关。MPO-DNA复合物水平与器官功能障碍及28 d病死率也密切相关。脓毒症患者及休克患者血浆中游离DNA含量增加，病死率提高。这可能是NET作为一种DAMP，通过活化TLR9受体启动炎症反应，促进炎症细胞在组织器官中浸润，加重组织脏器损伤［39］。组蛋白是NET的重要杀菌成分，抗菌的同时对内皮细胞有细胞毒性，可以损伤内皮细胞并且影响微血管灌注；并且可以通过促进凝血酶的生成、活化血小板和抑制抗凝血剂，促进DIC和血栓形成。中性粒细胞通过NET-血小板-凝血酶轴，促使NET大量增加，导致DIC及血栓形成，造成脓毒症发病率及死亡率上升。慢性肺系疾病中，大量NETs和中性粒细胞浸润会阻断气道，引起肺功能降低；还会引起肺纤维化、加重炎症反应、延迟伤口愈合等。

4.3 自噬自噬是细胞通过形成自噬体对胞质蛋白和细胞器进行降解的过程，对稳定细胞内环境具有十分重要的作用。自噬在细胞正常状态下就存在；在细胞营养匮乏、内质网压力、氧化应激、低氧和特定化学物质的暴露下被大量激活，以维持细胞生存。自噬由自噬相关蛋白（autophagy-related protein，Atg）调控，不同的Atg蛋白介导自噬体的起始、核化、延伸、成熟、融合、降解等过程［40］。自噬体成熟后，与溶酶体融合，溶酶体中的水解酶分解内膜及内容物使之变成小分子物质，让细胞再利用。中性粒细胞形成自噬体，一方面与溶酶体结合可以清除胞内坏死物质，维持中性粒细胞生存；另一方面，自噬体降解部分凋亡抑制产物，凋亡蛋白被激活，加速细胞凋亡，双向调节中性粒细胞寿命。自噬体脱落进入再循环，可以递呈抗原、调节适应性免疫。在中性粒细胞中，自噬可以促进细胞脱颗粒、杀菌和形成NET，还可以影响中性粒细胞的寿命，促进中性粒细胞的分化及成熟。

研究发现，在绿脓杆菌感染时自噬对骨髓中性粒细胞的黏附起促进作用，可以促进其杀菌功能。脓毒症存活患者体内中性粒细胞自噬增强，NET形成增加；死亡患者体内自噬失调、NET形成不足［39］。中性粒细胞的自噬机制可以维持其固有免疫效应功能，促进NET形成，控制感染，提高脓毒症患者存活率；NET还参与了血栓性组织因子（thrombogenic tissue factor，TF）的细胞外递送，激活了凝血级联反应，导致血栓形成［4］。自噬与脓毒症息息相关，通过药物增强中性粒细胞的自噬可以作为治疗脓毒症的新手段。

4.4 炎症小体形成和焦亡炎症小体主要是由模式识别受体、接头蛋白ASC和半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）前体结合形成的多蛋白复合物，可以参与Caspase-1依赖的细胞焦亡。焦亡是一种Caspase-1或Caspase-4/5/11依赖的伴随炎症的细胞程序性死亡方式，可以通过Caspace-1依赖和非依赖途径被激活，焦亡细胞膨大变形，胞膜破裂，并释放大量炎症因子。炎症小体激活的Caspace-1可剪切IL-1β和IL-18前体，产生成熟的IL-1β和IL-18，引起炎症反应；还可酶解GSDMD，促其形成具有N-结构域的肽段，并在胞膜上形成孔隙，诱导细胞破裂发生焦亡；大量炎症因子在胞膜破裂时释放出胞外，通过正反馈机制放大炎症反应。

中性粒细胞可以通过诱导炎症小体启动焦亡，而发挥其生物学功能。在此过程中，分泌大量IL-1β和IL-18，细胞胀大溶解，向胞外释放大量的免疫调节因子、趋化因子、髓过氧化物酶、CG等多种颗粒酶，促进NET形成，从而扩大炎症反应、杀灭病原体、控制感染，产生广泛的调节作用。发生焦亡的中性粒细胞胞膜溶解后，细胞器和细胞骨架并未简单散开，而是在细胞尸体内仍保持联系，形成一种陷阱样的结构，并将仍然存活的病原体困在其中，这种结构被称为孔诱导的胞内陷阱（pore induced intracellular trap，PIT），随后，其中的病原体会被ROS杀死或者被吞噬细胞二次吞噬后消灭，有利于胞内病原体的清除［41］。

脓毒症时，炎症小体的过度激活以Caspase-1依赖的经典焦亡途径诱导细胞焦亡，使IL-1β和IL-18大量释放，中性粒细胞大量浸润在肝肾等非特异性器官炎症介质经受损细胞膜释放，从而放大炎症反应、加快脓毒症进程，造成严重的组织损伤及器官功能障碍［42］。在LPS或盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型中，缺乏Caspase-11或GSDMD的小鼠死亡率降低，说明通过拮抗中性粒细胞的焦亡，有助于提高脓毒症的生存率，可能是由于减轻了中性粒细胞通过焦亡导致的过度的炎症反应。

5 脓毒症中，中性粒细胞与其他免疫细胞的关系

中性粒细胞不仅参与杀死胞外病原体，也可通过与其他细胞间的复杂交互作用参与对胞内病原体的清除，还可通过膜分子或分泌细胞因子对DC、淋巴细胞和NK细胞等细胞进行调节，这些发现将颠覆我们以往对中性粒细胞的认识，从仅仅是终末分化的效应细胞到参与整个免疫应答活动的转录的和功能性活化的调节细胞。脓毒症后期，中性粒细胞通过对淋巴细胞的接触性与非接触性抑制作用，导致免疫微环境中淋巴细胞失衡，并呈现免疫抑制状态，致使脓毒症复发或者继发感染。

5.1 中性粒细胞的潜在抗原提呈功能研究表明，N2型中性粒细胞具有很强的抗原递呈能力，可表达MHCⅡ类分子、CD80、CD86等相关抗原递呈分子，通过直接接触CD4+T细胞呈递抗原［43］。脓毒症小鼠，中性粒细胞MHCⅡ、CD80、CD86、CD40等分子的表达水平显著升高。故在脓毒症中，中性粒细胞可能具有抗原提呈能力，促进T淋巴细胞活化［44］。还有研究还发现中性粒细胞在真皮组织捕获病毒抗原后，可归巢于骨髓，在骨髓内激活CD8+T细胞，发挥抗原提呈功能，但其机制还不清楚［45］。

5.2 中性粒细胞对淋巴细胞的调节作用PD-L1和程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）是具有负向调节免疫功能的免疫检查点蛋白。PD-L1可结合PD-1，抑制了T细胞增殖和细胞因子分泌；还可与CD80结合，竞争性抑制CD80与配体结合，从而抑制T细胞激活通路。脓毒症时，IFN-γ可诱导中性粒细胞高表达PD-L1，通过PD-L1信号通路，负向调控淋巴细胞，抑制其增殖、活化及炎症性细胞因子的释放，促使淋巴细胞凋亡。PD-L1的水平与脓毒症病情及预后息息相关［46-47］。

脓毒症中，中性粒细胞还可通过分泌精氨酸酶1，分解L-精氨酸，影响T细胞正常细胞周期，使T细胞停留于G0～G1周期，导致T细胞功能障碍。系统性炎症状态时，CD11cbrightCD11bbrightCD16brightCD62Ldim中性粒细胞亚群也可以通过Mac-1，接触性抑制T细胞的增殖，抑制IFN-γ分泌，抑制T细胞功能。

炎症疾病中，辅助型T细胞（Th）分化为促炎Th1细胞与抗炎Th2细胞，两者的平衡在维持免疫稳态中有重要作用。中性粒细胞分泌IL-12与IL-4分别诱导初始性CD4+T细胞分化为Th1、Th2亚型。脓毒症时，Th2来源的IL-4数量增多，Th1与Th2失衡，呈现免疫抑制状态［48］。

5.3 对其他免疫细胞的调节中性粒细胞可与DC直接结合，促进DC成熟，增强其抗原提呈能力；还可调节NK细胞的成熟，可通过分泌IL-8调节NK细胞表达IFN-γ。中性粒细胞-巨噬细胞相互作用对于炎症的启动和消退都很重要。中性粒细胞的一级颗粒可促进吞噬细胞的吞噬作用和细胞因子分泌能力，增强其抗微生物效力。在严重的炎症状态下，中性粒细胞可诱导内皮细胞和上皮细胞信号改变，导致细胞间隙产生，利于血浆蛋白通过上皮屏障，形成水肿。中性粒细胞含有的中性粒细胞来源的肝素结合蛋白（neutrophil-derived heparin-binding protein，HBP）的释放可引起内皮细胞屏障的显著改变。在体内外失活HBP可阻止中性粒细胞从内皮细胞的高渗出。在肺水肿和重症脓毒症和休克患者中，血清内HBP水平已经被用来作为预测临床预后的指标［49］。

6 以中性粒细胞为治疗靶点的研究和临床应用现状

在脓毒症中，中性粒细胞参与抗感染、炎症诱导和免疫调节，其水平和功能状态与疾病发生、发展和预后密切相关。使之成为临床治疗的潜在靶点和判断病程和预后的潜在指征。

6.1 脓毒症的免疫治疗现状脓毒症早期表现为免疫紊乱和系统性炎症反应，晚期则表现为免疫抑制。对于脓毒症不同阶段应采取不同的免疫治疗策略，故在早期的抗炎治疗和晚期的免疫增强疗法，可能更有利于脓毒症临床症状改善和预后。在脓毒症发生的最早的几个小时应用抗炎治疗可以有效减少重症脓毒症患者的死亡风险。在72 h后，如果存在免疫抑制，则需要联合使用免疫激活剂治疗。免疫激活治疗可以降低脓毒症后期再次感染的风险，提高存活率。目前已经开展了针对众多免疫佐剂的治疗效果的研究和评价，IFN-γ、GM-CSF、IL-7和抗PD-1/PD-L1抗体这四种免疫激活剂研究最为深入。

国际专家认为因为脓毒症患者存在异质性，这些异质性体现在感染类型、易感性和感染部位的差异，也体现在患者的年龄、并发症和遗传背景、免疫功能状态的差异，这些差异都会导致临床试验的失败。错误地使用免疫治疗策略可导致患者发生更严重的感染，加重病情。故用生物标志物对患者进行分层是免疫治疗的先决条件。在多个临床试验中，淋巴细胞绝对数量和单核细胞HLA-DR水平是对患者分层的最常用指标。另外，可溶性PD1和MDSC水平也是潜在的生物标志物。

6.2 以中性粒细胞为靶点的诊治和临床应用现状

6.2.1 促进中性粒细胞生成和成熟 脓毒症中不成熟中性粒细胞和MDSC水平上调，可以导致免疫抑制状态。患者血液中高比例的G-MDSC与病情恶化和院内感染的发生率和病死率相关。抑制MDSC介导的免疫抑制状态、促进骨髓生成正常化细胞或诱导MDSC分化为成熟的髓细胞，有利于疾病恢复［50］。临床可使用GM-CSF和TLR激动剂促进中性粒细胞和MDSC成熟，来拮抗其免疫抑制表型。如前所述，GM-CSF可以加速中性粒细胞、单核巨噬细胞的产生，且促进单核细胞表达HLA-DR，恢复TNF表达能力。

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是调节中性粒细胞功能成熟、增殖和分化的主要粒细胞生长因子，在急性炎症中起到调节炎症介质释放的作用，被广泛应用于中性粒细胞减少的脓毒症患者［51］。在医院获得性肺炎和社区获得性肺炎引发的脓毒症患者中，G-CSF可以增加中性粒细胞的数量和功能；对于接受放疗和化疗的中性粒细胞数量减少的患者，使用G-CSF有利于减少脓毒症发病风险。尽管在脓毒症患者中，中性粒细胞水平通常是升高的，研究者推测G-CSF进一步增加中性粒细胞数量可以促进对病原体的杀伤。

6.2.2 改善中性粒细胞异常迁移脓毒症时，中性粒细胞的移行异常会加剧病情的发展，明确这些改变可以有助于寻找新的治疗靶点，提高生存率［3］。ICAM-1是血管内皮细胞表达的黏附分子，与中性粒细胞表面诱导表达的β2整合素结合，是介导中性粒细胞滚动黏附的关键分子。脓毒症中，ICAM-1与β2整合素亲和力增强，导致细胞僵化，诱导血管阻塞和组织缺氧损伤，是器官衰竭的重要因素。ICAM-l在非特异性器官内皮细胞的过度表达，也可能是导致脓毒症引起的器官组织损伤和功能紊乱的主要原因。研究发现，ICAM-1特异性抗体可使中性粒细胞向肺脏、胸腺、脾脏等非炎症性器官迁移减少，肺脏内数量减少，腹腔内数量显著增加，明显减轻肺损伤，促进机体清除细菌的能力增加，脓毒症的死亡率下降。故调节ICAM-1的表达水平也成为临床治疗的潜在靶点［52］。

CXCR2水平下降也是脓毒症个体中性粒细胞迁移异常的重要机制，也成为临床研究的重要靶点。研究发现，中药黄芪甲苷通过上调中性粒细胞趋化因子CXCR2表达，减少脏器细菌荷载量，增加CLP诱导的脓毒症小鼠存活率［53］。

脓毒症时，整合素表达异常可导致中性粒细胞迁移功能异常。人和小鼠的中性粒细胞β1/CD29表达上调，并介导淋巴细胞在血管周细胞外基质中黏附和运动，主要与富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列（arginyl-glycyl-aspartic acid，RGD）结合。条件性敲除β1后，可降低脓毒症的病死率。给脓毒症患者使用环形RGD类似物治疗可以减少中性粒细胞的渗出和迁移，提高生存率；也可以减少肺部中性粒细胞和巨噬细胞的迁移和聚集，从而减轻肺脏的炎症损伤［54］。

6.2.3 改善中性粒细胞功能NETs是以DNA为骨架与多种杀菌物质构成的网状结构，其参与脓毒症炎症反应、免疫及凝血，并可预测脓毒症患者的预后［55］。其与脓毒症的发生发展密切相关，有研究通过药物分解游离DNA，可以有效改善脓毒症的症状与预后。

LIU等［56］认为调节中性粒细胞焦亡是极具潜力的脓毒症治疗策略。中性粒细胞是脓毒症中最丰富的免疫细胞，也是IL-1β和IL-18的主要来源，因中性粒细胞具有寿命短和不能增殖的特点，促进中性粒细胞焦亡可以阻断Caspase-1/11和IL-1β/IL-18导致的连锁反应。

6.2.4 可用于病情评价的生物标志物外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil and lymphocyte ratio，NLR）是一个方便实用的检测指标，其代表淋巴细胞与中性粒细胞之间的平衡，可以准确评估脓毒症患者的病情和预后。在脓毒症中，细菌与各种毒素诱导的免疫激活会促进成熟和非成熟的淋巴细胞凋亡，导致中性粒细胞数量的增加和淋巴细胞数量的减少，NLR则升高［57］。LEE等［58］回顾分析了1 468例菌血症或脓毒症患者，根据血清降钙原水平判定当NLR＜5时可以排除脓毒症。ICU患者的初始NLR可以作为评估脓毒性休克患者28 d预后的指标。崔久庆等［59］分析了151例脓毒性休克的患者发现，当NLR≤17.01时，患者28 d的生存率可达到80%，而当NLR＞17.01时，生存率只有20%。

早期识别脓毒症及评估脓毒症患者的病情和预后非常重要。脓毒症小鼠和患者的中性粒细胞通过PD-L1的表达，以细胞接触的方式诱导淋巴细胞凋亡，从而促进免疫抑制。中性粒细胞PD-L1水平与受试的脓毒症患者的疾病严重程度呈正相关，提示中性粒细胞PD-L1可作为脓毒症患者预后的生物标志物［44］。PD-L1抗体通过阻断PD-L1/PD-1信号通路，可以恢复中性粒细胞导致的淋巴细胞免疫抑制。

7 总结与展望

中性粒细胞是人类外周血中含量最高的白细胞，是感染时率先被募集至炎症部位的固有免疫效应细胞，也是急性炎症过程中导致组织损伤的重要效应细胞，参与脓毒症的发生发展。具有清除病原体、介导炎症和免疫调节等功效。评估脓毒症如何影响中性粒细胞的功能，可能有助于开发新的有前景的脓毒症治疗策略。

当机体发生急性炎症时，活化的中性粒细胞会释放细胞因子、ROS、颗粒酶、NETs等杀菌物质，也可以诱导产生自噬体，互相协同发挥抗感染的作用，从而保护机体免受病原体的损害。在脓毒症早期，大量中性粒细胞被动员入血，且存在凋亡受阻、半衰期延长，导致中性粒细胞数量增多。过度活化的中性粒细胞，大量的杀菌物质产生，多种复杂生理机制协同，在抗感染的同时也导致免疫紊乱和系统性炎症反应，并进一步诱发凝血功能异常和组织损伤。在脓毒症晚期，中性粒细胞耗竭、中性粒细胞出现的移行和功能异常，使得中性粒细胞迁移受阻，无法到达感染部位控制感染，反而聚集在重要的器官造成严重损害。细胞自噬和焦亡功能异常，也可以促进NET形成，促进中性粒细胞膜损伤和大量炎性细胞因子释放，并进一步扩大炎症反应。未成熟中性粒细胞的释放入血以及抑制性功能亚群的诱导产生，不但不能有效清除感染，反而可以抑制淋巴细胞等其他免疫细胞的活化和功能，促进晚期免疫抑制状态的形成。这些复杂因素共同作用，导致多器官衰竭，加重脓毒症，甚至引起死亡。

在脓毒症治疗中，可以通过调节中性粒细胞的移行异常和过度的激活状态及恢复其功能来促进感染清除、减轻组织损伤程度，从而改善脓毒症的病情和预后。因此，探究中性粒细胞在脓毒症时的异常状态，可以寻找到脓毒症诊断治疗的新靶点。目前，以中性粒细胞作为临床诊断和治疗靶点的实验和临床应用研究已经开展，GM-CSF、C-CSF和抗PD-1/PD-L1抗体等治疗手段，在治疗脓毒症中都已经取得了很好的效果。