周文超 ，李政昊,2†，武 杰,2

（1. 中国科学院 长春光学精密机械与物理研究所 应用光学国家重点实验室, 吉林 长春 130033；2. 中国科学院大学, 北京 100049）

† 共同第一作者

1 引 言

单分子是探索生物性质过程的最小单元。对单分子的研究有助于发现生物系统中时间和空间的异质性，以及观测生物分子的潜在机制。单生物分子主要包括蛋白质、核酸、病毒和生物小分子等，高灵敏度检测可以量化单个生物分子，在临床诊断和探索潜在疾病等应用上，起到至关重要的作用。目前被广泛使用的单分子检测方法包括表面等离子体共振(SPR)，光波导光栅(OWG)，生物层干涉法(BLI)，酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和质谱分析法等，用于定量检测患者样本中的生物分子水平，检测结果对评估患者的健康状况和规划治疗方案非常重要。然而，血液、唾液或其他生物体液中许多潜在、起到决定性作用的蛋白质、核酸或生物标志物的浓度远低于当前方法的检测限，因此需要开发检测限更低的技术。具有在临床样本中测量低浓度生物标志物的能力，就可以通过无创或微创的方式提前发现疾病。因此，需要超灵敏的分析技术来检测和分析当前无法检测到的重要生物标志物。

单分子生物检测技术在低浓度蛋白、核酸和其他生物相关分子的超灵敏分析方面具有巨大的应用潜力。与传统方法检测生物分子整体平均值不同，单分子检测方法可以测量到单个生物分子层次。核酸作为生命的基本分子之一，具有储存、传递和表达遗传信息的能力，也与各种临床疾病密切相关，已成为临床诊断和治疗的重要依据。在核酸检测方面，该技术准确性高，可以直接识别碱基，实现核酸的长读取，从而发现新发致病结构变异。蛋白质分子在生物体中执行许多重要的任务，包括代谢催化、DNA 转录和复制、信号转导和分子运输等。在蛋白质与多肽检测方面，单分子生物传感器除了具有高灵敏度、特异性和选择性外，显示的分析时间更短，这使得临床环境和新的药物研发中的矩阵高通量分析成为可能。除了蛋白质和核酸，单分子检测还可以应用于在代谢途径、临床诊断和药物中发挥不同作用的小分子，发现活细胞中的个体异常，量化人体中含量极低的生物小分子，对解决生命科学中许多长期存在的问题具有十分重大的意义。

2 发展、分类及应用

霍尔于1956 年用透射电子显微镜（EM）拍摄到第一张单生物分子图像，包括脱氧核糖核酸（DNA）分子和胶原蛋白等生物分子，对细胞潜在过程的生物学机制研究有了实质性的突破[1]。1961 年，斯坦福医学院的Rotman 教授第一次实现单分子检测，他将含有β-半乳糖苷酶和荧光底物的混合溶液喷在硅油上，在油中产生液滴，每个液滴中含有0 个或1 个酶分子，经过数小时的等待，能够通过观察发出荧光的液滴来检测和测量出单个酶分子的存在[2]。随后，研究人员将膜片钳用于单分子的相关研究，为离子通道蛋白检测奠定了基础[3]。早在1976 年，Hirschfeld开始进行光学单分子检测的相关研究，使用异硫氰酸荧光素的80～100 个分子对20 000 kDa 聚乙烯亚胺进行标记，然后将这种高荧光聚合物与γ-球蛋白结合，使用全内反射显微镜，用高强度激光检测单个蛋白质分子。在完全光漂白之前最大化荧光信号（当时的探测器性能较现在的集成探测器略差，这样做可以尽可能多地收集光子），根据已知的分子浓度进行检测，观察荧光检测的预计数量[4]。这次实验非常重要，因为它是首次不使用酶的单分子测量，也是第一个使用全内反射进行单分子检测的研究。1988 年，Gelles 等人通过对计算机图像进行数字化处理，发现塑料珠可以在其中心的驱动蛋白马达驱动下，实现精度为纳米尺度的旋转[5]。在1990年，Orrit 和Bernard 首次检测到一个并五苯分子的荧光信号[6]。此后，随着荧光探针和超分辨率显微镜的发展，科学家们解决了许多复杂生物系统、多相催化、生物分子相互作用、酶系统和实时构象变化等长期存在的问题。1997 年首次将表面增强拉曼光谱（SERS）技术应用于单分子检测，为化学分析提供了一种前所未有的高含量、超灵敏的光学方法[7]。1998 年，谢晓亮团队首次利用荧光显微镜实时观察到单个酶蛋白分子的催化循环过程。这项研究成果成为单分子酶学的里程碑，成为单分子DNA 测序技术的核心技术[8]。Vgelstein 与Kinzter 于1999 年发表了采用数字PCR(digital PCR)方法定量检测结肠癌患者粪便中的微量K-RAS 基因突变的成果[9]。2006 年，首台数字式单分子免疫阵列蛋白分析仪Simoa HD1 面世。该检测平台由光纤微阵列技术和单分子检测技术构成，可进行单分子酶分析。2012 年，纽约冷泉港实验室的研究人员将Pacific Biosciences 单分子测序技术与Illumina 公司的传统测序技术相结合，用于修正单分子测序中的错误，结果表明该方法显著提高了测序结果的准确性[10]。布罗德研究所张锋团队于2017 年研发出一种全新的CRISPR 应用工具（SHERLOCK 系统）。该CRISPR 系统对于RNA 和DNA 的检测灵敏度均可达单分子级[11]。

2.1 纳米孔的单分子生物检测

在过去的几十年里，基于纳米孔的检测方法在许多学科和领域起到关键作用，包括生物医学、纳米尺度化学、生物物理学等。纳米孔单分子生物检测传感器由一个直径在1～100 nm 之间的孔，嵌入到或形成于两个含有电解质溶液的腔室的绝缘膜中，在外加电场作用下，离子自由流过纳米孔，形成稳态离子电流。在检测过程中，带电分子（核酸、多肽、蛋白质、聚合物分子等）阻塞纳米孔，导致孔隙离子电流下降，分子通过纳米孔后，电流会恢复正常，分子在纳米孔中通过产生的电信号可传达出生物分子的尺寸、浓度、结构等信息。待测生物分子的尺寸与纳米孔尺寸越接近，从孔隙通过产生的离子电流信号波动越明显[4]。纳米孔单分子传感器每次只通过一个待测分子，表现出对单一个体的极强灵敏度。此外，纳米孔检测技术具有重复性高、操作简单、成本低、有助于理解单分子行为等优点。纳米孔包括生物纳米孔与固态纳米孔两类，都可进行单分子层次的生物检测。

2.1.1 生物纳米孔

生物纳米孔的优点是具有良好的三维结构和高复现性。常用的生物纳米孔包括α 溶血素[12]、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)[13]、气溶素(AeL)[14]、Fragaceatoxinc (frac)纳米孔[15]等，也可由双层膜中的生物合成或固相合成的小肽（小于100 个氨基酸的肽）产生，研究人员还通过软件设计出由DNA链构成的DNA 折纸纳米孔，可以控制纳米孔结构尺寸[16]。生物纳米孔也称为跨膜蛋白通道，第一个用于单生物分子检测的纳米孔是α 溶血素。其孔通道宽度只可以通过单链DNA，双链DNA尺寸过大无法通过，从而实现了对单链DNA 的检测[17]。随着研究的深入，生物纳米孔也用于癌症生物标志物、对映异构体、miRNA、多肽与蛋白质等分子的传感。弗吉尼亚大学相关研究团队研发了一种基于光谱的单分子纳米孔用于表征水溶性肽。这项技术的基础原理是利用生物蛋白的纳米孔分解不同大小的分子，利用Au25(SG)18团簇来改善聚乙二醇(PEG)的检测结果，增加多肽对孔的开启和关闭率（如图1所示）。同时，溶剂/溶液的pH 值对提高多肽的活性也有重要作用，在单分子检测中表现出相应的信号波动[18]。

图1 （a）阴离子Au25(SG)18 团簇增强纳米孔检测示意图及（b）相应的电流强度[18]Fig. 1 (a) Schematic diagram of the anionic Au25(SG)18 cluster-enhanced nanopore detection and (b) it"s corresponding current traces[18]

2.1.2 固态纳米孔

固态纳米孔较生物纳米孔表现出更强的鲁棒性，制备方法可与传统半导体制造工艺兼容，也可以与微流体及光学检测方法集成。控制其孔隙几何形状，使其与生物分子相匹配。在电解质中施加电压，使带电的生物分子在电泳力作用下通过纳米孔，可以提高易位过程中产生的离子电流阈值，并最大限度地提高信噪比[19]。

在纳米孔为主体的检测系统中，孔径无法通过以光传播的方式进行检测的纳米孔称为零模波导（ZMWs）。ZMWs 通常由金属铝制成，置于透明衬底上，并要降低背景荧光。对于孔径小于光波长的金属纳米孔，即光波无法通过，但生物分子仍能通过的孔隙，将待测生物分子进行荧光标记。在一定的光照下，金属膜上方的荧光分子层被金属膜屏蔽，因此，只有位于孔底部的荧光团能产生可检测的信号（如图2 所示，彩图见期刊电子版）。零模波导多用于DNA 和蛋白质生物分子的检测以及单分子的生物物理学研究等[20]。

图2 不同材料架构的零模波导（ZMW）等离子体纳米孔[20]。（a）深紫外等离子体增强Al ZMW 单蛋白自身荧光。（b）用于增强单分子探测的Au-Si 零模混合波导。（c）等离子体纳米孔器件结构增强单分子荧光检测，该结构由金膜制备的纳米孔和独立式氮化硅膜制备的纳米孔组成。Fig. 2 Various material framework of zero-mode waveguide (ZMW) plasma nanopore[20]. (a)The autofluorescence of Al ZMW monoprotein was enhanced by deep ultraviolet plasma. (b) Au-Si zero-mode hybrid waveguides for enhanced single-molecule detection. (c)The plasma nanopore device structure enhances single-molecule fluorescence detection,which consists of nanopore prepared by gold film and nanopore prepared by independent silicon nitride film.

以ZMWs 为基础，目前普遍使用金代替铝，使其产生强的等离子体共振效应。等离子体与固态纳米孔检测技术集成，在灵敏度、特异性、阵列检测、持续时间等方面有所提升。在等离子体纳米孔周围的电磁场起到增强光学光谱、提高荧光标记分析物信号、实现分子和离子在传感器之间热迁移的作用。高限制的等离子体场可用于增强标记了适当荧光染料的生物分子的荧光能量（FE）和荧光共振能量转移（FRET）[21]。利用等离子体纳米孔技术对电磁场进行限制，可以对背景荧光产生很强的抑制作用，同时将FE 净增强10 倍以上。

2.1.3 相关应用

2.1.3.1 核酸检测

纳米孔核酸检测读取长度不受限制，小型化纳米孔核酸检测仪器可用于实时检测。通过单分子检测，直接进行核酸读取，不需要进行扩增的方法被称为第三代测序。纳米孔核酸检测利用DNA穿过孔时，产生的电荷变化来识别不同的核酸[22-23]。对于临床样本，一般利用杂交原理构建的生物传感器的灵敏度和选择性存在缺陷，由于血清中存在其他各种蛋白和非靶核酸，可导致离子电流阻滞干扰靶信号等问题[24]。纳米孔核酸检测的难点之一是控制DNA 链通过纳米孔的易位速度，时间过短会导致采集到的电流特征信号无法被记录或记录错误。研究人员发现对于生物纳米孔可以在待测DNA 分子入口处使用分子马达，如DNA聚合酶或解旋酶，可以显著降低DNA 的移动速度，并在核酸水平上精确控制DNA 移动[25]。DNA链中相邻核酸之间的长度只有0.5 nm，膜的厚度了决定测序的分辨率，更薄的厚度可使识别更加准确，随着石墨烯材料的出现，发现其厚度与核酸之间间距相当，具有很高的空间分辨率，并且具有高机动和栅可调载流子的电子导电性，可应用于纳米孔单分子检测[26]。氮化硅作为一种可靠的半导体相关材料，使用氮化硅薄膜制造纳米孔更适合大规模生产，目前发现的最短有效厚度约为1.7～1.8 nm，大约可容纳4 个连续的核酸[27]。Burck等人最近提出了一种基于纳米孔的生化分析方法。其利用纳米孔中的光电传感技术对小的外周血循环中的游离DNA 片段进行定量分析，证明小鼠血液中特异性检测ERBB2 S310F 和PIK3CA H1047R 的基因突变[28]。

2.1.3.2 蛋白质与多肽检测

蛋白质与多肽都是由氨基酸组成的。与DNA测序不同的是，纳米孔技术无法对蛋白质或多肽的每个氨基酸进行测序，所以研究人员把精力集中在区分单一氨基酸上。单氨基酸检测灵敏度与分子通过纳米孔的易位速度相关，Yuan 等人使用未修饰的气溶胶纳米孔与待测氨基酸之间的氢键成功检测出单个半胱氨酸[29]。为了检测单氨基酸分辨率下的多肽，研究人员将不同分子量的多肽用不同阻滞信号幅度加以区分，Piguet等人在单氨基酸分辨率下对混合溶液或独立的均荷电短同肽(5～10 个氨基酸)进行了大小区分。在这项研究中，气溶胶纳米孔是完全未经修饰的，可以正确区分不同长度的多肽[30]。2019年，Matteo Dal Peraro 课题组以纳米孔单分子检测技术为基础，对气溶素的离子选择能力与传感能力展开研究。因为气溶素与其他生物纳米孔的区别主要在于其孔径长度，研究发现其能力主要由静电和双β-桶的最狭小部分直径控制，较长的孔与直径较小的孔径相结合可使分子的易位变慢，可实现对多肽分子更高精度的检测[31]。2021 年，荷兰格罗宁根大学的Giovanni Maglia 教授通过低pH 条件以及在孔道内引入芳香族氨基酸突变的方法，提高了多肽在纳米孔中的停留时间、捕获频率和分辨率，同时对纳米孔的多肽传感机制做出一定验证，为纳米孔的多肽检测提供了一种切实可行的方法[32]。同年，为了促进蛋白质纳米孔的实际应用，LI M Y 团队通过纳米孔实验与分子动力学模拟，实现了高度特异的离子电流强度对待测物体积差分辨（如图3 所示，彩图见期刊电子版）[33]。

图3 通过野生型气溶胶膜通道运输C-A3 和mC-A3[33]。（a）气溶胶纳米孔模型。气溶素（灰色）嵌入脂质双层膜（深蓝色），核苷酸（红色）放置在孔的入口；（b）含有甲基胞嘧啶和胞嘧啶的甲基化和非甲基化寡核苷酸结构。红色部分为添加的甲基部分Fig. 3 Transporting C-A3 and mC-A3 through a wild-type aerolysin membrane channel[33]. (a) All-atom model of the fulllength aerolysin nanopore system. Aerolysin (gray) was inserted into a lipid bilayer membrane (dark blue), while nucleotides (red) were placed at the entrance of the pore. (b) Structure of methylated and unmethylated oligonucleotides containing methylcytosine and cytosine, respectively. The only difference between them was the addition of a methyl group which is marked in red

2.2 数字式单分子生物检测

数字式单分子生物检测通过将待测分子以统计学原理分离出“有”与“无”两种状态，对“有”的分子进行计数，获得待测分子数量。与批量检测方法相比，数字式单分子生物检测系统在对蛋白质和核酸的测量上具有明显优势。在批量测量中，待测物的浓度与信号强度成比例，样本总体的特异性被忽略，只能测量平均活性。与整体检测相比，数字式检测与信号强度无关，读取单个信号的有无并进行计数[34]。数字式单分子生物检测将单个带有荧光底物的酶分子加载到飞升体积大小的微孔中，在微孔中每个酶分子都能催化大量底物使其转化为荧光分子，产生较高的局部浓度，观测含有荧光信号的微孔，计算酶分子的数量。以微磁珠为载体将待测生物分子与荧光底物捕获到单个飞升体积大小的微孔或微反应器中，对微孔阵列中每个孔中的荧光信号同时进行数据采集，通过增加微磁珠被捕获的概率检测浓度极低的待测分子（如图4 所示，彩图见期刊电子版）[35]。

图4 微磁珠加载示意图[35]。（a）使用磁力和亲-疏水微孔阵列高效加载微磁珠。（b）直径、间距和深度不同的微孔阵列在多次循环下的加载率。（c、d）40 倍显微镜下加载前后的亮场显微图像。（e）100 倍显微镜下加载后的亮场显微图像Fig. 4 Magnetic bead seeding[35]. (a) Schematic of the magnetic bead seeding on HIH microwell arrays. (b) The bead distribution in arrays with varying well diameters, array pitches and well depths, for multiple-seeding cycles. (c,d) ×40 magnification bright field microscopy image of a microwell array before and after magnetic bead seeding, respectively. (e)×100 magnification bright field microscopy image of a microwell array after seeding

Rissin 课题组提出以微珠为载体的ELISA 单分子阵列检测方法，使检测过程更加稳定，可实现单个蛋白质分子的检测[36]。首先使用单个蛋白分子被结合抗体的微珠捕获，携带蛋白分子的微珠遵循泊松分布的百分比，即每个珠粒结合一个或零个目标分子，与加入生物素化的检测抗体形成三明治式免疫复合物，然后用链霉亲和素结合的β-半乳糖苷酶进行标记，将微珠与荧光底物共同加入到与微孔尺寸相匹配的微孔阵列中，即每个微孔最多存在一颗微珠（如图5 所示）[37]。通过这种方法，可以使捕获的单个蛋白分子被分离在独立的孔中。微孔封闭后，通过观察微孔上的荧光数量计算单目标分子。每个单独的微反应器在这个过程中起到分散待测分子，数字化检测目标的作用。蛋白质浓度是通过测量同时含有珠粒和荧光产物的孔数与含有珠粒的孔总数的比率来确定的。该方法大大降低了检测抗体和酶的使用量，也减少了与微珠的非特异性结合，降低了背景噪声。因此，数字式单分子生物检测方法的检测限比传统ELISA 低1 000 倍。

图5 数字ELISA 示意图[37]。（a）抗体结合微珠捕获单个目标生物分子，然后由另一个与标记抗体结合的抗体检测。将微珠装入飞升微孔阵列中用于分离和检测单个分子。（b）产生单分子信号的飞升微孔阵列的一部分荧光图像。大多数飞升体积微孔含有一颗微珠，但这些珠中只有一小部分具有催化酶活性，表明是一种单一的结合蛋白。（c）蛋白质在本体溶液中的浓度与结合蛋白质分子的微珠的百分比关系Fig. 5 Schematic representation of digital ELISA[37]. (a) Antibody-coated beads captures the single target biomolecules, which are then detected by another antibody conjugated with a labeled antibody. Loading of beads into femtoliter well arrays for isolation and detection of single molecules. (b) Fluorescence image of a small section of the femtoliter well array after signals from single molecules are generated.While the majority of femtoliter chambers contain a bead from the assay, only a fraction of those beads possesses catalytic enzyme activity, indicative of a single, bound protein. (c) The concentration of protein in the bulk solution is correlated to the percentage of beads that have bound a protein molecule

数字式单分子检测方法提高了研究人员对酶机制和酶群体的异质性理解，将单酶分子捕获到具有荧光底物的微孔中，在高通量的微孔阵列中同时观测大量酶分子的活性，能够获得酶群长期的动力学状态。数字式单分子检测方法也可以直接以外周血为检测对象，通过提取其生物标志物定量分析自身循环系统血浆中的细胞因子含量，与痊愈患者进行比较，观察产生的生理变化，用于评估免疫疗法的效果[38]。

2.2.1 核酸检测

目前大多数的核酸检测需要对目标DNA 或RNA 进行扩增，通常使用聚合酶链式反应(PCR)。在定量PCR (qPCR)中，每个扩增周期后通过荧光增强程度判断扩增产物的相对丰度。这种方法可以在短时间内将目标序列扩增100 万次以上，所需样本量小[39]。除此之外，包括滚动环扩增反应(RCA)、杂交化链式反应(HCR)和环介导等温扩增(LAMP)等技术也可用于核酸检测，但是这些方法往往耗时费力、需要消耗大量样本、并且灵敏度不足。

为了解决这些问题并获得更高的灵敏度，数字PCR 方法对样品进行稀释，并将其划分到含有一个或零个目标模板分子的孔中，从而允许对目标序列进行排除扩增偏差的绝对定量[40]，由此发展出的液滴数字PCR (ddPCR)方法利用油包水乳化液滴限制单个核酸靶点，能够实现大规模数字化检测。此外，数字式ELISA 的检测方法能够在不需要进行DNA 扩增的条件下，检测亚飞摩浓度的基因组DNA[41]。该方法成功检测到全血中浓度为0.016 fmol/L 的金黄色葡萄球菌的基因组DNA。数字式ELISA 方法对miRNA的检测也具有极高的灵敏度，通过与目标miRNA序列互补的锁定核酸探针的直接杂交，检测限可达到1～10 fmol/L，能够通过多重检测飞摩浓度的具有单核苷酸错配的同源miRNA[42]。除了高灵敏度之外，该方法还解决了逆转录定量PCR（miRNA 检测的金标准方法）所面临的样品丢失和扩增变异的问题（如图6所示，彩图见期刊电子版）[43]。

图6 数字式单分子阵列检测技术进行MicroRNA 检测[43]。（a）单个miRNA 分子通过与生物素化的探测器探针杂交到探针化的顺磁珠中被捕获。随后加入链霉亲和素结合酶来标记捕获的miRNA 复合物，以便在与荧光酶底物孵育时产生荧光信号。（b）单个微珠与荧光衬底一起装入飞升微孔阵列，随后用油密封。然后将孔上荧光的数量作为目标miRNA浓度的数字读数Fig. 6 MicroRNA detection with digital single molecule detection technology[43]. (a) Individual miRNA molecules are captured by hybridization to probecoated paramagnetic beads, along with biotinylated detector probe. The streptavidin-conjugated enzyme is subsequently added to label the captured miRNA complex, to allow generation of a fluorescent signal upon incubation with a fluorogenic enzyme substrate. (b) Individual beads are loaded along with fluorogenic substrate into a femtoliter microwell array, which is subsequently sealed with oil. The number of fluorescent “on” wells is then counted as a digital readout of the target miRNA concentration

2.2.2 蛋白质检测

数字式单分子检测技术最大应用领域之一是对神经病学和神经退行性疾病的诊断。常见的检测对象包括神经丝光(NfL)、Tau 蛋白、淀粉样蛋白(Aβ)、α-突触蛋白 (a-synuclein)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。这些蛋白在血浆中的浓度低于在脑脊液（CSF）中的浓度，血浆检测比脑脊液检测对人体的伤害小很多，因此需要一种灵敏度极高的技术，获得对血浆中低浓度蛋白质的技术量化检测指标，如数字式ELISA 单分子检测技术。Mattsson 团队证实患老年痴呆症患者神经丝光NfL 血浆水平（平均51.0 ng/L）显著高于认知健康的对照组的检测物水平（平均34.7 ng/L），而轻度认知障碍患者（平均42.8 ng/L）与其他两组之间无显著差异[44]。其他研究人员也通过对血浆中NfL量化，确认额颞叶痴呆症与其相关，且血浆中的NfL 浓度与脑脊液中浓度呈正相关。Gill 课题组使用单分子阵列技术对疑似轻度创伤性脑损伤(mTBI)患者与健康对照组的tau、NfL 和GFAP进行测量，结果表明患者血浆中检测蛋白含量明显偏高[45-46]。鲁汶大学生物传感器研究人员使用同一检测方法对阿摩到皮摩的Tau 蛋白水平进行量化，证明了所提出的检测方法与不同生物样品中Tau 浓度范围具有兼容性，获得55±29 aM 的检测限，灵敏度较商用产品提高了5 000 倍[47]。在另一项研究中，Dinh 等研究人员使用数字式ELISA 方法测量血清与尿液中肉毒杆菌神经毒素A1(BoNT/A1)量化值，检测限分别达到200 pg/L和1 ng/L[48]。

除神经学标志物外，单分子阵列技术也越来越多地应用于检测血液中的肿瘤标志物、心脏验证标志物、自身免疫性疾病中的细胞因子与趋化因子等。

2.2.3 小分子的单分子检测

为了检测单个小分子，Wang 课题组将单分子阵列检测调整为一种竞争性免疫分析形式，分析修饰的微珠或分析标记的酶与样品中的目标分析物竞争结合，竞争免疫分析法成功用于检测唾液和血清中的皮质醇和前列腺素E2。结果表明竞争免疫分析法对小分子的灵敏度较传统竞争ELISA 法高出约50 倍[49]。

通过将单个分子限制在飞升级微反应器阵列中，基于微孔的检测技术为检测单个目标分子提供了一种强大的工具，提高了灵敏度。随着灵敏度、小型化和成本效益的不断提高，这种单分子生物检测技术在推进临床诊断和理解疾病机制方面表现出重要的潜力。

2.3 回音壁模式光学谐振腔（WGM）单分子生物检测

回音壁模式光学谐振腔（WGM）作为无标的微纳米传感器，可以让人们直接在光下观察单分子水平的动态过程，具有高时间和空间分辨率，并且能够响应影响光模式分布的环境扰动。WGM器件具有高灵敏度，此外，其结构具有多样性且易于与现有制造设备(如传统的基于芯片的技术)集成，促使WGM 传感器广泛用于生物分子检测。典型的WGM 传感器由一个低噪声泵浦光源和一个高Q 值微腔组成。通过光的全反射将光波限制在谐振腔内，循环的光波会产生自干涉光学共振，光波倏逝场从微腔激发延伸到周围的介质中，当生物分子与纳米级光场重叠时，就会产生检测信号（WGM 共振漂移）。理论上，生物分子与光相互作用，光波每循环一圈，路径长度都会发生一些变化，这种路径长度的变化使光的共振波长或频率发生偏移[50]。利用谐振腔表面散射损失和吸收损失导致光学共振频率信号变化，可实现生物分子的高灵敏检测（如图7 所示，彩图见期刊电子版）[51]。为了将WGM 的检测能力提升到单分子级别，可以通过增强光与金属纳米结构上分子的相互作用而实现，使用金属纳米结构将光集中在超出衍射极限的深亚波长尺度，以增强与单一分子的相互作用。然而，用这种方法获得的单分子高分辨率，导致传感部分缩小，有效传感面积为纳米粒子的结合部分的表面积，在与NPs 结合时，只有少量分子可以被识别[52]。另一种基于光学WGM 与微腔的机械本征模耦合的传感方法，不受这种传感体积减小的影响，其用足够的功率激发空腔内的光波导，其共振频率相对于谐振频率略有蓝移，则可以在亚Hz 线宽的频率Vm上引起谐振腔的相干光机械振荡(OMO)，振荡频率和它的高次谐波可以直接由腔发射的功率谱确定。由于腔内光场本身就像光弹簧一样做机械运动，OMO 的频率取决于激发频率相对于WGM共振位置的失谐[53]。为了检测特定的生物分子，需要使用分析特异性捕获剂（抗体[54]、抗体片段[55]、互补核酸适体[56]、其他识别分子）对WGM进行修饰，在捕获剂将待测分子捕获到传感区域中时，会导致共振波长偏移，由于这一现象，WGM 已被用于核酸、病毒、蛋白质、端粒酶活性等目标的检测。研究人员基于该原理成功检测到大肠杆菌聚合酶打开和关闭时信号的变化。通过改变检测波长，也可以在蛋白质不同体积的位置探测单蛋白质动力学，这种多模态WGM 传感器甚至可以使蛋白质的三维动力学达到原子级分辨率，成为单分子动力学研究的重要工具。

图7 由谐振腔表面的全内反射激发的WGM[51]Fig. 7 Illustration of a WGM cavity excited by frustrated total internal reflection at a prism surface[51]

2.3.1 单分子检测应用

WGM 的检测方法为无标检测，其对分子的类型往往无法识别，通常使用与待测分子尺寸匹配的微粒子代替。病毒一直对人类构成潜在威胁，早在2008 年，Vollmer F 课题组首次报道了使用模式偏移技术检测单个甲型流感病毒粒子(半径约50 nm)，从微球形WGM 的共振频率/波长的离散变化观察到单个病毒粒子的结合，通过减小微球的尺寸，可以增强离散波移信号的幅度。在使用与病毒大小相当的聚苯乙烯纳米颗粒的实验中，证实传感机制与模式体积成反比。将此效应的基础电磁理论与实验进行比较，既可以从最佳共振位移直接获得结合病毒粒子的大小和质量[57]。美国伊利诺伊大学研究团队应用无标的硅光子微环谐振器直接在一个复杂的分析矩阵检测完整病毒的纯化样品，并且对菜豆荚斑驳病毒(一种重要的农业病原体)实现了定量检测，检测限为10 ng/mL。通过在缓冲液中研磨少量叶片样本，于45 min 内，就可以识别受感染的叶片[58]。空气中也存在很多微小的病毒分子，Shao L 团队研究人员基于自由空间耦合的微环面成功检测出了单个聚苯乙烯颗粒(半径为70 nm)以及空气中的病毒粒子[59]。蛋白质的尺寸通常小于病毒的尺寸，在对蛋白质分子进行检测时，就需要更高的灵敏度WGM 检测装置，才能实现对蛋白质的定量检测。许多研究小组已经实现了在纯缓冲溶液和复杂介质中对蛋白质的直接检测[60-61]。Robison H M 课题组利用循环免疫细胞中结核相关抗原和对照抗原暴露进行多重细胞因子免疫分析，验证了适用于结核杆菌(LTBI)的7-plex 细胞因子检测。该方法具有良好的动态范围、检测限和重现性，与单酶联免疫吸附测定法具有良好的相关性，准确地检测和量化了患者的PBMCs 在结核相关抗原和对照抗原刺激后分泌的7 种细胞因子浓度，并与强大的特征选择方法相结合，揭示了与LTBI 状态和再激活风险相关的个体规范化免疫信号[62]。近期，肖云峰教授和龚旗煌院士课题组首先成功制备出壁厚约为1 μm 的微泡腔，并利用热光效应进行筛选，进一步将微泡腔接入微流系统构成微流光学传感器，并成功实现了单链DNA 分子的检测[63]。

2.3.2 蛋白质分子构象动力学检测

蛋白质结构内的动态运动是极其复杂的，涉及到与结构运动和波动相关的不同时间尺度、运动幅度和不同方向。大多数蛋白质的功能来自于复杂的三维结构和结构的改变，通常在与其他分子的相互作用，或环境条件如温度和PH 值的变化时发出响应，蛋白质可以在很短的时间间隔内采用许多不同的构象，因此检测蛋白质的构象动态对于更好地理解其生物学功能至关重要。为了观察蛋白质的结构动力学，常常需要对单个分子进行研究。研究单个蛋白构象变化的一种方法是将光集中在深亚波长尺度上，以增强与单一蛋白质的相互作用。通过附加一个等离子体金属纳米棒，可以将光集中到一个蛋白质的尺寸(约10 nm)，生物分子与这种光场相互作用可产生检测信号[64]。通过这种方法，已经有科研人员实现对固定在WGM 传感器上的活性聚合酶的构象运动的检测。利用这种无标的光学检测方法观测出单分子水平上的相互作用和相关的构象变化[65]。为了实现具有多个传感通道的WGM 传感器平台，研究人员利用不同的激光探测蛋白质分子动力学，从而获得蛋白质不同部分的动力学信息。通过使用等离子体金纳米颗粒耦合WGMs，以微秒时间分辨率探测周转期间的酶构象动力学，对单分子水平上酶周转的温度依赖进行研究，并对其建立物理模型，成为研究酶周转和热力学之间关系的重要工具[66]。

2.4 表面增强拉曼光谱（SERS）单分子生物检测

拉曼光谱是一种功能强大的分析工具，可以探测分子的震动指纹信号，根据拉曼光谱固有的特异性，可以对物理、化学和生物的复合系统进行分析。这种光学技术具有低损害性和用途广泛等特点，可用于固体、液体和气体样品的研究，已被应用于化学检测、疾病诊断和环境监测等领域。然而，自发拉曼散射很弱，拉曼光谱的灵敏度较低。表面增强拉曼光谱(SERS)能够显著增强表面吸附分子的拉曼信号，克服传统拉曼光谱灵敏度低的限制。经过技术的不断完善，SERS 技术在生物传感领域表现出优异的灵敏度。通常利用互补核酸、抗体和适配体作为识别病毒的识别元件[67]。在SERS 发展的早期阶段，使用表面粗糙的金属衬底，能够为被检测分子提供良好的拉曼增强[68-69]。但是，由于粗糙的金属基底对场的增强能力有限，不足以满足单分子检测。随后，研究证明大幅的电磁增强，可以使测量非共振分子拉曼微分截面的SERS 信号在10-29～ 10-30cm2/sr范围内[70]。SERS 衬底(如非晶态Au 衬底)表面原子迁移会使测量到的单分子信号受到影响[71]。在SERS 理论中，电磁场方法激活的拉曼增强因子与局域电场增强的四次方成正比，表示为：

其中E0(r0,ω)是 入射光的电场，E(r0,ω)为热点处的局部电场。相应的增强拉曼强度可表示为：

其中A表示实际中与用于采集拉曼信号的光学系统的采集效率相关的系数；| α(ωR,ω)|表示被检测分子的拉曼极化率；I0(r0,∞)表示入射光强度[72]。根据公式（2）可知，使用特定的光学系统来提高SERS 测量的灵敏度，主要有两种增强方法。一个是局域电场增强，对应于EM，另一个是增加被检测分子的拉曼极化率，对应于CM。

SERS 单分子生物检测可以在不统计平均值的情况下观察单分子中细微的光谱现象。实验验证，SERS 单分子检测可以准确观察到拉曼峰的均匀展宽和非均匀展宽。在应用方面，SERS 单分子生物检测显著增加了拉曼光谱的可应用区域[73]。利用单分子SERS 技术，在单分子水平上实现了对还原氧化反应和催化反应的实时监测，可用于指导具有最高催化活性的多相生物催化剂的设计[74]。

2.4.1 病毒检测

病毒感染是导致人类发病和死亡的主要原因之一，给卫生保健系统造成了重大经济成本。SERS 技术是一种非常可靠的常规病毒感染快速识别技术。谱分析统计方法的发展使得人们能够对同一病毒不同毒株的SERS 光谱加以区分。例如，银纳米棒阵列用于SERS 技术可检测几种致病性病毒，如腺病毒、鼻病毒和人类免疫缺陷病毒等[75]。此外，还可以区分不同毒株的甲型流感病毒[76]、呼吸道合胞病毒[61]和轮状病毒[77]。Oganes Ambartsumyan 课题组于2021 年，以多层金底物制备新型SERS，成功识别出浓度为106pfu/ml的腺病毒和柯萨奇病毒(其中pfu 是斑块形成单位，即感染病毒颗粒的数量)[61]。相关研究团队还使用SERS 检测方法磁捕获病毒基因组，使用镀金的顺磁纳米粒子(NPs)，其既可用作SERS 底物，也可作为从其他成分靶向纯化病毒基因组的高效方法[78]。而Saira Nasir 课题组通过SERS 方法，采用多元数据分析技术，实现对血液样本中丙型肝炎病毒(HCV)的定性与定量分析，准确率达99%[75]。采用夹心法对流感病毒进行全病毒捕获和血凝素适配体鉴定。初级适配体附着在SERS底物的金属颗粒上，捕获流感病毒并与具有拉曼活性分子标记的二级适配体结合。捕获流感病毒颗粒后，加入拉曼染料标记的二级适配体（如图8 所示，彩图见期刊电子版），使用拉曼染料在生物液中几分钟完成检测，并成功检测到多种A 型流感病毒株[79]。

图8 核酸适体的病毒颗粒在固体基质上的检测[79]Fig. 8 Detection of virus particles of aptamer on solid substrates[79]

2.4.2 蛋白质检测

SERS 可以检测蛋白质的内在信号，因此可以作为一种有效的蛋白质检测方法。PENG Y S课题组于2021 年利用Nb2C 和Ta2C MXenes 在电荷转移共振增强和电磁增强的协同作用下，显著增强SERS，准确识别5×10-9M 的SARS-CoV-2刺突蛋白，有利于实现新型冠状病毒的实时监测和预警[80]。随后，2022 年DELPHINE 课题组也对世界范围内快速传播的新冠病毒进行SERS 检测，通过对人体的SARS-CoV-2 刺突蛋白单链抗体文库进行生物筛选，获得了结合SARS-CoV-2刺突蛋白的单链抗体片段。将单链抗体与磁性纳米颗粒和SERS 纳米标记相结合，形成免疫复合物，在病毒载体中检测SARS-CoV-2 刺突蛋白，30 min 内检测限为257 fg/mL。同时检测到B.1.1.7 (alpha)、B.1.351 (beta)和B.1.617.2 (delta)刺突蛋白，与冠状病毒HKU1 刺突蛋白无交叉反应[81]。LIU B 课题组基于金银核壳结构的SERS 纳米标记和多氯联苯(PCBS)相结合的生物传感器，实现具有宽线性动态范围的蛋白质超灵敏检测。结果表明，该生物传感器对小鼠免疫球蛋白G（IgG）具有良好的检测限672 fg/mL，线性动态检测范围为10 pg/mL～10 μg/mL[82]。然而，由于SERS 信号的复杂性和不可靠性，需要对目标蛋白进行纯化。科研人员在SERS 的基础上研发直接免疫分析(SERSIA)技术离心，将金纳米颗粒(GNPs)均匀地包裹在目标蛋白上，与靶蛋白密切接触，可以检测到靶蛋白的内在信号，能够在微米范围内对固定化蛋白进行定量成像[83]。

2.4.3 生物标志物检测

SERS 被认为是一种非常有前途的超灵敏技术，甚至可以检测单个分子，长期以来一直被认为是一种强大的微量生物标志物分析工具。同步的癌症生物标志物检测为癌症的早期诊断带来了巨大希望。在相关检测初期，SERS 单分子生物检测可用于同时检测多种肝癌相关的microRNA(miRNA)生物标志物，通过合成3 种高度均匀、可重复的纳米标记，产生强烈的SERS 信号，其具有特征的拉曼光谱。上述结果表明SERS 纳米标记具有很高的灵敏度和优良的复用检测能力，在研究3 个目标miRNA 的同时，通过多重和定量测定，成功地进行了矩阵分析，检测限在皮摩范围内[84]。最近，国内研究团队使用SERS的检测方法对外泌体和上清血液中的microRNA，通过Fe3O4@Ag-SERS 辅助增强接受信号，单基的错配识别达到1aM，在这个灵敏度下，可以将胰腺癌与慢性胰腺炎(CP)和正常对照(NC)区分开来[85]。随着新型分析技术的发展，矩阵化生物检测方法越来越受到人们的重视，采用光子晶体(PC)和SERS 作为两种编码元素，在不同模式下对多重生物检测进行双重编码。在实践中，PC 微珠和SERS 纳米标记分别作为载体和标签，以三明治形式对抗原进行多重检测。双编码多重生物检测具有极低的背景和干扰，以及高稳定性和重复性。定量分析结果表明，该检测系统具有良好的分析性能和较高的灵敏度。对肿瘤标志物AFP 和CEA 的多重检测结果表明，该方法具有灵敏度高、检测范围广、交叉反应性低的特点[86]。LI 课题组利用SERS 有序金纳米蜂窝阵列可同时灵敏检测3 个或3 个以上目标。SERS 是一种有效的分子成像光学形态，由于其固有的性质，生成的增强拉曼光谱分析物接近纳米粗糙银等贵金属表面(Ag)或金(Au)。由于化学物质独特的窄指纹拉曼光谱，SERS 技术为生物医学研究提供了多参数分子分析和多路复用等具有重要意义的方法。这些特征增强的拉曼光谱从一个特定的分子物种可以明确用来识别和量化混合物中的不同目标[87]。

2.5 CRISPR（聚簇规则间隔短回文重复）单分子检测

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic repeats)序列是一种基于基因组编辑的技术，目前已被广泛应用于生物学研究中[88]。CRISPR 不仅可以用于核酸生物标志物的检测，以其为基础的特异性高灵敏度酶促报告子解锁(SHERLOCK)和DNA内切酶靶向CRISPR 反式报告系统(DETECTR)对检测病毒与细菌核酸也表现出单分子层次的超高灵敏度（如图9 所示，彩图见期刊电子版）[89]。这些方法灵敏度可以用于检测特定的阿摩尔单链DNA 或RNA 序列和高特异性的单碱基错配。

图9 两种检测病毒RNA 的CRISPR 方法[89]。（a）SHERLOCK 方法；（b）DETECTR 方法Fig. 9 Two CRISPR methods for detecting viral RNA[89]. (a) SHERLOCK assay; (b) DETECTR assay

基于CRISPR 的方法也适用于矩阵检测。例如，使用具有特定切割偏好的不同Cas 酶进行多重SHERLOCK 测定，实现了4 个RNA 和DNA 靶点的多重检测，保持了在阿摩级范围内的灵敏度[90]。SHERLOCK 和DETECTR 的 主 要 优 点 是它们适用于即时诊断。SHERLOCK 已经在基于纸张的横向流动分析中实现超灵敏的核酸检测，可以快速检测核酸（小于90 min），且检测仪器便于制造。SHERLOCK 更被用于检测血清、唾液和尿液样本矩阵中的登革热和寨卡病毒[91]。SHERLOCK 还因其具有检测单碱基差异的能力，可用来区分密切相关的病毒株[92]。该技术还被用于检测引起宫颈癌的人乳头瘤病毒，采用DETECTR 对两种不同类型的人乳头状瘤病毒(HPV)进行检测，响应时间为1 h。其他Cas 酶与DETECTR 配合检测可以提高检测性能，例如Cas14检测DNA 单核苷酸多态性（基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性；SNPs）用于检测游离细胞的DNA，可用于癌症的诊断[93]。

3 单分子检测方法总结

在这篇综述中，介绍了一些前沿的单分子检测方法及相关应用，并对文中综述的检测方法的特点进行汇总（表1）。

表1 文中不同单分子生物检测方法的优缺点对比Tab.1 Advantages and disadvantages of various methods of single molecule biological detection

4 未来展望及总结

不同方法的灵敏度、特异性、动态范围、矩阵检测和成本对于单分子检测技术都十分重要。单分子生物检测在生命科学领域具有革命性的突破，不仅在于对疾病的早期诊断与治疗上，更突出体现在准确了解潜在生物学机制上。许多检测方法不能提供足够的敏感性和特异性，单分子生物检测的目的是可以实现对生物分子的定量分析，定量是理解反应动力学和生物系统分子动力学的核心，也是核酸检测、测量从病变细胞分泌到血液中的蛋白质、测量与神经系统疾病相关的生物标记物等的核心。在这些技术中，生物传感器对单个分子表现出较高的灵敏度和选择性。基于单分子检测的方法都具有各自的优势，虽然这些检测方法或系统得到了优秀的实验结果，大幅提高了原有的灵敏度与分辨率，但还存在很多需要突破的关键方向，比如，待测分子的实时量化、生物体内或细胞内的生物传感、多路复用能力、不同生物分子检测的通用性、检测速率等仍存在局限性。这是未来能够让人们对生命科学有更深认识的关键，需要科研人员共同努力继续优化，解决尚存的问题，以应用、实用为主，实现多种正交技术的分析。