曾 光，胡晓晖，杨 超，杜 然

肾癌是一种起自肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，是泌尿系统肿瘤相关死亡的主要原因之一[1]。诱发肾癌的因素众多，如吸烟、肥胖、高血压等，肾癌的发病率近年来逐年上升[2]。绝大多数肾癌患者对化疗和放疗都不敏感，手术是肾癌的主要治疗方式[3]。积极探索新的分子靶向治疗药物是改善肾癌患者预后的重要手段。随着非编码RNA研究的进展，微小RNA(miRNA)被证实对各种肿瘤细胞的恶性生物学行为都能产生抑制作用[4]。其中，miR-4701-5p是一种新发现的miRNA，由miR-4701剪切生成[5]。研究表明，miR-4701-5p在肺腺癌组织和细胞株中低表达，恢复miR-4701-5p表达能够抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，改善肺腺癌细胞的顺铂耐药性，发挥明显的肿瘤抑制作用[6]。miR-4701-5p在肾癌中的表达及对肾癌恶性表型的影响报道较少。本研究旨在探讨肾癌组织和细胞株中miR-4701-5p的表达水平，观察恢复miR-4701-5p表达对肾癌细胞增殖和迁移的影响，并初步研究其机制，为临床针对肾癌的靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞株及试剂 人肾癌细胞株OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20及正常肾小管上皮细胞株HK-2购自武汉典型培养物保藏中心。LipofectamineTM2000试剂和TRIzol试剂盒均购自美国Invitrogen公司。miR-4701-5p mimic、mimic NC购自北京索莱宝公司。胎牛血清和高糖培养基均购自美国Thermo Scientific HyClone公司。趋化因子受体4(CXCR4) mRNA野生型载体(psi-CHECK-2-CXCR4-WT)质粒、CXCR4 mRNA突变型载体(psi-CHECK-2-CXCR4-MUT)质粒购自美国Promega公司。辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4购自美国BD公司。

1.2细胞培养和分组处理 OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20细胞复苏后在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，HK-2细胞复苏后在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，在37 ℃ 5% CO2条件下常规培养。传代4～5次，取对数生长期SK-RC-20细胞培养于6孔板，将SK-RC-20细胞分为miR-4701-5p mimic组和mimic NC组，分别加入miR-4701-5p mimic、mimic NC，操作按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书执行，常规培养48 h后用于后续检测。

1.3miR-4701-5p表达分析和靶基因预测 通过TCGA数据库在线分析miR-4701-5p在肾癌组织和癌旁组织中的表达水平差异。应用生物信息学软件miRGator对miR-4701-5p与CXCR4 mRNA的靶向关系进行预测。

1.4qPCR检测细胞中miR-4701-5p和CXCR4 mRNA的表达 所有细胞均采用Trizol试剂提取总RNA，经超微量核酸检测仪检测RNA浓度和纯度，通过逆转录试剂盒合成cDNA。建立qPCR循环体系，qPCR引物序列：GAPDH上游：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游：GCGCCCAATACGACCAAATC；rRNA18S上游：ATTCCGATAACGAACGAGAC，下游：TCACAGACCTGTTATTGCTC；miR-4701-5p上游：ATGAGTTGGCCACCACACCTA，下游：TTGGCCACCACACCTACCCCTT；CXCR4上游：ACTACACCGAGGAAATGGGCT，下游：CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA。miR-4701-5p和CXCR4 mRNA表达水平采用2-ΔΔCt方法计算。

1.5双荧光素酶报告基因实验验证miR-4701-5p与CXCR4的靶向关系 将SK-RC-20细胞分为CXCR4-WT组和CXCR4-MUT组，分别将miR-4701-5p mimic、mimic NC与构建的CXCR4-WT和CXCR4-MUT荧光质粒共转染，每组4个复孔。孵育48 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测各组SK-RC-20细胞萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。

1.6集落形成实验法检测SK-RC-20细胞的增殖能力 采用胰酶消化各转染组SK-RC-20细胞，以2 ml细胞悬液接种于6孔细胞培养板，每孔2×103个细胞，培养10 d后弃上清，采用2%多聚甲醛进行固定，采用结晶紫染液进行染色。流水充分清洗后，室温下风干，计数统计每孔的集落形成数。

1.7Transwell实验检测SK-RC-20细胞的迁移能力 采用胰酶消化各转染组SK-RC-20细胞，以500 μl细胞悬液接种于Transwell小室上室，加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基于下室。培养箱孵育24 h，采用2%多聚甲醛进行固定，采用Giemsa染液进行染色，采用棉签擦掉未穿过底膜的细胞。在40倍光学显微镜下选择6个视野拍照并统计迁移细胞数。

1.8Western blotting检测SK-RC-20细胞中CXCR4蛋白和YAP信号通路蛋白的表达 采用胰酶消化各转染组SK-RC-20细胞，采用PBS清洗5次，用RIPA裂解液裂解并提取细胞总蛋白，分别取60 μg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳以及硝酸纤维素膜转膜。于10%脱脂牛奶中封闭150 min，分别孵育一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4(浓度均为1∶1000)，加入1∶4000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，均匀孵育，化学发光显色液，在暗室中曝光、显影，β-Tubulin为内参蛋白。

2 结果

2.1miR-4701-5p在肾癌组织和肾癌细胞株中的表达 TCGA数据库显示，肾癌组织中miR-4701-5p的表达水平低于癌旁组织(P<0.01)，见图1。qPCR检测结果显示，miR-4701-5p在肾癌OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20细胞株中的表达水平低于HK-2细胞，SK-RC-20细胞株中miR-4701-5p表达低于OS-RC-2、A498、ACHN细胞(P<0.05，P<0.01)，见图2。故选择SK-RC-20细胞进行后续实验。

图1 miR-4701-5p在肾癌组织及癌旁组织中的表达情况

图2 miR-4701-5p在肾癌细胞株中的表达情况

2.2miR-4701-5p过表达效率 转染后，mimic NC组和miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞中miR-4701-5p表达水平分别为1.03±0.47和11.02±1.72。miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞中miR-4701-5p表达率高于mimic NC组(P<0.01)。

2.3miR-4701-5p过表达可抑制SK-RC-20细胞的增殖 集落形成实验结果显示，miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞集落形成数少于mimic NC组(P<0.01)。见图3。

图3 miR-4701-5p过表达对SK-RC-20细胞增殖的影响

2.4miR-4701-5p过表达可抑制SK-RC-20细胞的迁移 Transwell实验结果显示，miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞迁移细胞数少于mimic NC组(P<0.05)，见图4。

2.5miR-4701-5p靶向结合CXCR4 mRNA 通过生物信息学软件miRGator预测显示，CXCR4 mRNA序列上存在与miR-4701-5p互补结合的位点，见图5。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染CXCR4 mRNA野生型载体/miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞株中相对荧光素酶活性低于mimic NC组(P<0.01);共转染CXCR4 mRNA突变型载体/miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞株中相对荧光素酶活性与mimic NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

图5 miR-4701-5p与CXCR4 mRNA的靶向关系CXCR4为趋化因子受体4

图6 SK-RC-20细胞株中miR-4701-5p相对荧光素酶活性

2.6miR-4701-5p靶向抑制CXCR4 mRNA表达 mimic NC组和miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞株中CXCR4 mRNA表达水平分别为6.91±1.48和1.05±0.46。miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞株中CXCR4 mRNA表达量低于mimic NC组(P<0.01)。

2.7CXCR4蛋白和YAP信号通路蛋白表达 与mimic NC组相比，miR-4701-5p mimic组SK-RC-20细胞中CXCR4蛋白及YAP信号通路蛋白YAP、CTGF、ANKRD1表达水平均明显降低。见图7。

图7 miR-4701-5p对SK-RC-20细胞中CXCR4蛋白及YAP信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

近年来研究显示，miRNA在疾病的发生和发展过程中发挥重要调控作用，已成为各种疾病治疗研究的热点[7-9]。miRNA在肾癌诊断、治疗和预后监测方面可能具有应用潜力[10-11]。HUANG等[12]发现，miR-140-5p在肾癌组织中表达上调，其在体外能够促进肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭，敲除miR-140-5p可显著抑制肾癌裸鼠模型的肿瘤生长和肺转移。ZENG等[13]发现，miR-92a-3p在肾癌组织和细胞株中表达显著上调，miR-92a-3p过表达促进肾癌细胞增殖和集落形成，下调miR-92a-3p则抑制肾癌细胞增殖和集落形成。miR-4701-5p在多种疾病中起关键作用[6]。BI等[5]研究发现，miR-4701-5p能够显著抑制类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖、迁移和侵袭。LI等[14]研究发现，miR-4701-5p在体外可降低慢性粒细胞白血病细胞对多种化疗药物的耐药性，并且在小鼠体内将肿瘤细胞从阿霉素耐药转化为易感细胞。本研究结果显示，在肾癌组织和细胞株中miR-4701-5p表达水平分别低于癌旁组织和正常肾小管上皮细胞，提示miR-4701-5p可能发挥抑制肾癌进展的作用。

本研究体外实验显示，miR-4701-5p过表达能够显著降低SK-RC-20细胞的增殖水平和迁移能力。研究表明，miRNA通过靶向结合靶基因mRNA，下调靶基因的表达，影响肿瘤细胞的恶性表型[15]。本研究通过生物信息学软件miRGator预测显示，CXCR4 mRNA序列上存在与miR-4701-5p互补结合的位点。CXCR4蛋白属于具有化学趋化作用的细胞因子超家族成员，其基因定位在染色体2q21，大小为352个氨基酸[16]。CXCR4参与介导肿瘤发生、免疫反应、血管生成等各种病理和生理进程[17]。CXCR4在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤中高表达，诱导肿瘤细胞的增殖和转移，与患者的预后呈负相关[18]。CXCR4在肾癌组织和细胞株中高表达，能够显著增强肾癌786-O和769-P细胞的增殖和迁移[19]。本研究结果显示，miR-4701-5p可以靶向结合并抑制CXCR4基因的表达，CXCR4是miR-4701-5p的靶基因。已有研究证实，CXCR4蛋白通过激活YAP信号通路，诱导肿瘤的进展[20]。本研究结果显示，miR-4701-5p过表达显著抑制YAP信号通路的激活，进一步证实miR-4701-5p通过调节CXCR4基因表达发挥作用。

综上所述，miR-4701-5p在肾癌组织和细胞株中表达降低，miR-4701-5p过表达可以靶向抑制CXCR4基因表达，进而抑制YAP信号通路的激活，减弱肾癌SK-RC-20细胞增殖和迁移。miR-4701-5p可能成为肾癌基因治疗研究的新靶点。