程 雷，李梓欣，刘传富，张 万，郝梦帅，李 峰

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)为菊科多年生草本植物，性寒，味苦，具有清热解表、健胃消炎、消肿散结、利尿等功效，常用于治疗感冒发热、喉咙肿痛、尿路感染等症[1-2]。研究表明，蒲公英具有抗炎、抗肿瘤、调节血糖、增强免疫力等多种药理作用[3]。蒲公英全草富含酚酸类、多糖类、黄酮类、甾醇类等多种化学成分，其花、叶和根中所含的酚酸类成分主要是菊苣酸(chicoric acid)和单咖啡酰酒石酸[4]。其中，菊苣酸作为一种重要的生物活性成分，具有抗病毒、调血脂、清除自由基、降血糖等药理作用[5]。菊苣酸可经化学合成制得[6]，也可从天然产物中提取分离获得。文献[7]报道，用于提取菊苣酸的天然植物主要是菊苣和紫锥菊，提取方法主要采用超声波法和加热回流法。超声波法具有提取温度低、高效快速、提取时间短、穿透力强、提取率高等特点，与加热回流法相比具有独特的优势，适用于提取对热不稳定的生物活性成分[8]。

目前，以蒲公英为原料提取菊苣酸的研究鲜有报道。菊苣酸对热不稳定[9]，鉴于此，作者采用超声波法提取蒲公英中菊苣酸，通过HPLC法测定蒲公英中菊苣酸含量，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面法优化蒲公英中菊苣酸的超声提取工艺，为蒲公英资源的进一步开发利用提供技术支持。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

蒲公英干燥全草,购自山西，由山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为菊科植物蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)。蒲公英干燥全草经粉碎机粉碎,过40目筛，备用。

菊苣酸标准品(批号Y02J12Y136139，纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；乙腈、磷酸,色谱纯；无水乙醇、甲醇,分析纯；实验用水为超纯水。

Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；FW-80型高速万能粉碎机，北京永光明医疗仪器有限公司；FA2004B型电子天平，上海天美天平仪器有限公司；CPA 2250型电子分析天平，德国赛多利斯公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司。

1.2 蒲公英中菊苣酸含量的测定

1.2.1 标准溶液的制备

精密称取6 mg菊苣酸标准品，用80%甲醇溶解后，转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即得浓度为600 μg·mL-1的菊苣酸标准溶液。

1.2.2 供试溶液的制备

精密称取0.5 g蒲公英粉末于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL 50%乙醇，称重，在超声温度为50 ℃、超声功率为300 W的条件下超声提取50 min；冷却至室温，再次称重，并补足失重，混匀，抽滤，所得滤液即为供试溶液。

1.2.3 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温35 ℃；流动相为0.2%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，90%～78%A；10～14 min，78%～60%A；14～16 min，60%A；16～17 min，60%～90%A)；流速1.5 mL·min-1；检测波长330 nm；进样量5 μL。

菊苣酸标准溶液和供试溶液的HPLC图谱见图1。

1.3 蒲公英中菊苣酸的提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

分别考察乙醇和甲醇体积分数(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g，下同)、提取时间(30 min、40 min、50 min、60 min、70 min)、超声功率(200 W、300 W、400 W、500 W)对蒲公英中菊苣酸提取率的影响。按下式计算蒲公英中菊苣酸提取率：

式中：c为提取液中菊苣酸浓度,μg·mL-1；V为提取液体积，mL；m为蒲公英粉末质量，g；M为蒲公英中菊苣酸的含量，mg·g-1。

1.3.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，选择对蒲公英中菊苣酸提取率影响较大的液料比(A)、提取时间(B)、超声功率(C)为考察因素，以菊苣酸提取率(Y)为响应值，运用Design-Expert 8.0.6软件进行3因素3水平响应面实验设计。

2 结果与讨论

2.1 菊苣酸含量测定的方法学考察

2.1.1 线性关系

分别精密吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、0.9 mL菊苣酸标准溶液于1 mL容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，混匀，按1.2.3色谱条件进样测定，以峰面积(y)为纵坐标、菊苣酸浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，拟合得线性方程为y=14.75x-318.5，R2=0.9996。表明，菊苣酸浓度在60～540 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.2 精密度

取供试溶液，按1.2.3色谱条件重复进样测定6次。测得菊苣酸峰面积的RSD值为0.98%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性

取同一供试溶液8份，分别放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h，按1.2.3色谱条件进样测定。测得菊苣酸峰面积的RSD值为0.25%，表明24 h内菊苣酸的稳定性良好。

2.1.4 重复性

平行配制6份供试溶液，分别按1.2.3色谱条件进样测定。测得菊苣酸峰面积的RSD值为0.44%，表明该方法的重复性良好。

2.1.5 加标回收率

精密称取适量菊苣酸标准品，用50%乙醇超声辅助溶解，转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，按1.2.3色谱条件进样测定，得到浓度为456.35 μg·mL-1的菊苣酸标准溶液。精密称定0.25 g菊苣酸含量已知的蒲公英粉末6份于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入2 mL菊苣酸标准溶液、8 mL 50%乙醇，按1.2.2条件超声提取，平行制备供试溶液，按1.2.3色谱条件进样测定。测得菊苣酸的平均加标回收率为104.6%，RSD值为1.73%。

2.1.6 蒲公英中菊苣酸含量的测定

取同一批次的蒲公英药材，按1.2.2条件平行制备6份供试溶液，按1.2.3色谱条件进样测定。通过外标法计算得到蒲公英中菊苣酸含量为7.438 2 mg·g-1。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 醇体积分数的影响

精密称取12份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞锥形瓶中，分别加入一定量不同体积分数的乙醇和甲醇，在超声温度为50 ℃、液料比为20∶1、超声功率为200 W的条件下超声提取30 min，考察醇体积分数对菊苣酸提取率的影响，结果见图2。

图2 乙醇和甲醇的体积分数对菊苣酸提取率的影响

由图2可知，随着醇体积分数的增大，菊苣酸提取率整体逐渐升高；当醇体积分数为50%时，菊苣酸提取率最高；当醇体积分数继续增大时，菊苣酸提取率降低。原因可能是，菊苣酸的分子结构中含有羧基和较多酚羟基，在植物体中易形成盐，菊苣酸盐在高浓度的醇溶液中溶解度降低，导致菊苣酸提取率降低。通过比较不同体积分数的乙醇和甲醇对菊苣酸提取率的影响，同时考虑到甲醇具有毒性，确定较适宜的提取溶剂为50%乙醇。

2.2.2 液料比的影响

精密称取5份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞锥形瓶中，分别按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入50%乙醇，在超声温度为50 ℃、超声功率为200 W、提取时间为30 min的条件下提取，考察液料比对菊苣酸提取率的影响，结果见图3。

图3 液料比对菊苣酸提取率的影响

由图3可知，随着液料比的增大，即提取溶剂乙醇用量的增加，菊苣酸提取率逐渐升高，当液料比为50∶1时，菊苣酸提取率最高。这是由于，增加提取溶剂用量可以提高细胞内外菊苣酸的浓度差，更有利于菊苣酸分子在溶液中扩散，使得菊苣酸的溶出量增加，进而提高菊苣酸提取率。当液料比由40∶1增大到50∶1时，菊苣酸提取率的升幅不明显，为了节约提取溶剂，确定较适宜的液料比为40∶1。

2.2.3 提取时间的影响

精密称取5份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞锥形瓶中，按液料比30∶1加入50%乙醇，在超声温度为50 ℃、超声功率为200 W的条件下分别超声提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，考察提取时间对菊苣酸提取率的影响，结果见图4。

图4 提取时间对菊苣酸提取率的影响

由图4可知，提取时间在30～40 min范围内时，菊苣酸提取率随提取时间的延长而升高；当提取时间为40 min时，菊苣酸提取率最高；而在40～50 min范围内时，菊苣酸提取率随提取时间的延长而降低。可能是由于，菊苣酸在溶液中不稳定[9]，部分发生降解所致。在50 min后，菊苣酸提取率缓慢回升，可能是由于，提取时间继续延长，菊苣酸的溶出速率大于降解速率，溶出量增加。因此，确定较适宜的提取时间为40 min。

2.2.4 超声功率的影响

精密称取4份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞锥形瓶中，按液料比30∶1加入50%乙醇，在超声温度为50 ℃、提取时间为40 min、超声功率分别为200 W、300 W、400 W、500 W的条件下提取，考察超声功率对菊苣酸提取率的影响，结果见图5。

由图5可知，随着超声功率的增大，菊苣酸提取率逐渐升高；当超声功率超过400 W时，菊苣酸提取率的升幅趋缓；当超声功率为500 W时，菊苣酸提取率最高。原因可能是，超声功率增大，超声波的空化作用和机械作用增强，使得植物细胞壁的破裂程度提高，从而加速了菊苣酸的溶出。考虑到降低能耗，确定较适宜的超声功率为400 W。

图5 超声功率对菊苣酸提取率的影响

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计与结果(表1)

表1 响应面实验设计与结果

2.3.2 回归模型的建立与方差分析

通过对表1数据进行回归拟合分析，得到二次多项式回归方程为：Y=92.96+5.47A+1.12B-3.20C-0.12AB+1.65AC+0.47BC-1.81A2-1.57B2-5.70C2。

回归模型的方差分析见表2。

表2 回归模型的方差分析

一次项A、C，二次项C2对菊苣酸提取率的影响极显著，一次项B，交互项AB、AC、BC，二次项A2、B2的影响均不显著。通过比较F值的大小可判断[10]，各因素对菊苣酸提取率的影响大小为：液料比(A)>超声功率(C)>提取时间(B)。

2.3.3 响应面分析

响应面图可直观地反映交互作用对响应值的影响，响应曲面越陡峭，说明交互作用对菊苣酸提取率的影响越显著[11]。各因素交互作用对菊苣酸提取率影响的响应面图及等高线见图6。

由图6可知，交互作用影响菊苣酸提取率的顺序为AC>BC>AB，符合方差分析中F值的判断结果。

图6 各因素交互作用对菊苣酸提取率影响的响应面图及等高线图

2.3.4 回归模型的优化

由于不显著项对回归模型的影响有时会干扰模型对响应值的拟合，导致模型出现过拟合现象，因此通过忽略交互项AB、AC、BC以及二次项B2对模型的影响，降低模型的复杂度。优化后的回归方程为：Y=92.30+5.47A+1.12B-3.20C-1.89A2-5.78C2。

优化后回归模型的方差分析见表3。

表3 优化后回归模型的方差分析

2.3.5 最佳提取工艺的确定及验证

经优化后回归模型分析得出的最佳提取工艺为：液料比40∶1、提取时间50 min、超声功率272.26 W，在此条件下，菊苣酸提取率的理论值为97.4368%。考虑到实际可操作性，将最佳提取工艺修正为：液料比40∶1、提取时间50 min、超声功率300 W。经3次验证实验，得到菊苣酸平均提取率为95.34%，与理论值的相对误差为2.15%，表明优化后的回归模型有较好的预测性能，优化得到的提取工艺稳定可靠，可用于蒲公英中菊苣酸的提取。

3 结论

以醇体积分数、液料比、提取时间、超声功率为考察因素，以蒲公英中菊苣酸提取率为评价指标，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面法优化蒲公英中菊苣酸的超声提取工艺。确定最佳提取工艺为：以50%乙醇为提取溶剂、液料比40∶1(mL∶g)、提取时间50 min、超声功率300 W，在此条件下，蒲公英中菊苣酸提取率为95.34%。