孙美丽，汪汉成，郭沫言，蔡刘体，刘亭亭，陆 宁，史彩华

(1.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025；2.贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081)

0 引言

【研究意义】由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的烟草靶斑病(Tobacco target spot)是烟叶旺长期易发生的真菌性病害，造成叶片褪绿、轮纹等症状，严重时可形成连片融合病斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，导致烟叶失去经济价值[1-2]。立枯丝核菌除危害烟草外，还可引起烟草立枯病[3]、水稻纹枯病[4]等多种病害。该病原寄主范围广泛，包括烟草、水稻、马铃薯、甜菜等260余种作物[3-6]。2018—2021年，烟草靶斑病在云南、贵州等烟叶主产区危害严重[7]，局地损失高达80%以上，存在广泛传播与流行的风险，建立绿色高效的防控技术体系意义重大。【前人研究进展】国内外学者分别从农业防治[8]、生物防治[9]等不同角度研发了大量防控技术，但均存在防治成本高、防效不显著、费工费时等缺陷。化学防控病虫害仍然是烟农最青睐的方法，经济高效，而且省工省时，是植物病害最为经济、有效的防控措施。生产上，有机和无机杀菌剂常被用于防治立枯丝核菌引起的植物病害[10-11]，如井冈霉素(Jiangangmycin)、苯醚甲环唑(Difenoconazole)等。【研究切入点】由于我国烟草特殊的农药登记政策，目前，国内烟草上登记防控烟草靶斑病的药剂仅有井冈霉素，该药剂对靶斑病具有较好预防作用，但病情严重时仍难以控制。同时，烟农习惯性将用于防控烟草赤星病的菌核净(Dimethachlon)和代森锰锌(Mancozeb)用来防控包括靶斑病在内的多种真菌性病害。【拟解决的关键问题】测定苯醚甲环唑、嘧菌酯、菌核净和代森锰锌4种杀菌剂对烟草靶斑病菌菌丝生长和菌核形成的生物活性，并在田间进行药效评价，为烟草靶斑病防控替代药剂的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地点及品种 田间药剂试验于2020年8月中旬在贵州省毕节市黔西县高坡村烟田进行，供试品种为云烟87，烟草种子购自毕节市烟草公司黔西县分公司。

1.1.2 供试菌株及培养基 烟草靶斑病菌菌株BEZ11、BEZ13和J203，由贵州省烟草科学研究院微生物实验室前期分离、鉴定。测试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)。

1.1.3 供试药剂及器械 96.80%苯醚甲环唑(Difenoconazole)原药购自山东寿光双星农药有限公司，96%嘧菌酯(Azoxystrobin)原药购自南京百慕达生物科技有限公司，90%菌核净(Dimethachlon)原药购自浙江禾益农化有限公司，85%代森锰锌(Mancozeb)原药购自杜邦(中国)集团有限公司。

分别购置10%苯醚甲环唑水分散粒剂(WG，商品名：势丽，一帆生物科技集团有限公司)、25%嘧菌酯悬浮剂(SC，商品名：阿加西，盐城利民农化有限公司)、40%菌核净可湿性粉剂(WP，商品名：禾益，江西禾益化工股份有限公司)和80%代森锰锌可湿性粉剂(WP，商品名：大生，陶氏益农农业科技有限公司)，用于田间药效试验。多功能喷雾施肥器(型号：DSF01A-20-100)，购自贵州黔丰源农业科技开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同药剂对靶斑病菌菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法[12]测定。将代森锰锌溶于无菌水、嘧菌酯和苯醚甲环唑溶于甲醇、菌核净溶于丙酮中，均分别配成1.0×104mg/L的母液，于4℃黑暗条件下保存，备用。杀菌剂的最终测试质量浓度：苯醚甲环唑0 mg/L、0.31 mg/L、0.63 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L；嘧菌酯0 mg/L、6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L；菌核净0 mg/L、0.16 mg/L、0.31 mg/L、0.62 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L；代森锰锌0 mg/L、9.38 mg/L、18.75 mg/L、37.5 mg/L、75 mg/L、150 mg/L、300 mg/L。以添加相同体积的甲醇、丙酮处理作为空白对照，其中甲醇、丙酮的体积分数均小于0.25%，此浓度溶剂均不影响靶斑病病菌菌丝的生长。将供试菌株在PDA培养基上活化，7 d后在菌落边缘制备直径为5 mm的菌碟，接种于不同浓度梯度含药平板中央，各处理3次重复，接菌后将平板置于25℃恒温培养箱中黑暗培养。待对照菌落直径长至2/3培养皿直径时，采用“十字交叉”法测量菌落直径，计算各药剂不同剂量下对病原菌菌丝生长的抑制率[13]。

抑制率= [(对照菌落直径-5 mm)-(处理菌落直径-5 mm)]/(对照菌落直径-5 mm)× 100%

1.2.2 不同药剂对靶斑病菌菌核形成的抑制作用 采用称重法[14]测定，将1.2.1中培养的平皿继续置于25℃恒温培养箱中黑暗培养，50 d后从各平板上挑取褐色菌核称重，计算各药剂不同剂量下对病原菌菌核形成的抑制率。

1.2.3 对烟草靶斑病的田间防效 选取烟株长势一致的烟田划分小区，随机排列，每小区20株烟株，重复3次。10%苯醚甲环唑WP、25%嘧菌酯SC、40%菌核净WP和80%代森锰锌WP的田间用量分别为60 g/667m2、40 mL/667m2、120 g/667m2和200 g/667m2，于烟草靶斑病零星出现病斑时开始用药，采用多功能喷雾施肥器均匀喷施叶片表面，直至液滴流失。以喷施等量清水处理为对照，小区之间设保护行。每处理施药前在烟株相同部位分别标记8个病斑，并量取病斑直径。施药后9 d，分别再次量取各标记病斑的直径，计算药剂对病害扩展的抑制率。同时各小区随机选择8株烟株，参照烟草靶斑病病害分级标准调查各处理的病情指数[15]，计算各药剂对烟草靶斑病的防效。

病斑抑制率= [1-(处理区病斑直径扩增值/对照区病斑直径扩增值)]×100%

病情指数=Σ(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×最高病级值)×100

防治效果= [1-(处理区病情指数增长值/对照区病情指数增长值)]×100%

1.3 数据处理

采用Excel 2019对试验数据进行处理，以杀菌剂质量浓度对数值为横坐标，以对病原菌菌丝生长抑制率的几率值为纵坐标，建立毒力回归方程，根据毒力回归方程计算有效抑制中浓度(EC50)值和相关系数[16]。使用DPS 7.0.5.8进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对靶斑病菌菌丝生长的抑制作用

由表1可见，4种杀菌剂对烟草靶斑病菌菌丝生长均表现出不同抑菌活性，其中抑菌活性最强的是菌核净，其EC50值为1.57～2.00 mg/L，平均值为(1.72±0.25)mg/L；嘧菌酯次之，其EC50值为14.13～16.68 mg/L，平均值为(15.71±1.38)mg/L；苯醚甲环唑稍弱，其EC50值为13.81～18.38 mg/L，平均值为(16.80±2.59)mg/L；代森锰锌最弱，其EC50值为13.88～35.87 mg/L，平均值为(24.77±11.10)mg/L。

表1 供试4 种杀菌剂对烟草靶斑病菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibition effect of four fungicides against mycelium growth of R. solani

此外，烟草靶斑病菌不同菌株对同种药剂的敏感性存在差异。其中，对代森锰锌的敏感性差异最大，菌株J203的EC50值是菌株BEZ13的2.58倍；其次是苯醚甲环唑，菌株J203的EC50值是菌株BEZ13的1.33倍；相比而言，不同菌株对嘧菌酯和菌核净的敏感性差异较小。

2.2 不同药剂对靶斑病菌菌核形成的抑制作用

由表2可见，在测试浓度范围内，4种杀菌剂对烟草靶斑病菌菌核的形成均表现不同的抑制活性。在50 d菌核形成期内，抑制活性最强的药剂为菌核净，在2.5 mg/L处理时的抑制率为100%；其次是嘧菌酯和苯醚甲环唑，嘧菌酯药剂浓度在12.5 mg/L、50 mg/L和100 mg/L处理时的抑制率均为100%，苯醚甲环唑药剂浓度在5 mg/L处理时的抑制率为(98.59± 2.45)%；代森锰锌的抑制作用相对较弱，在18.75 mg/L处理时的抑制率为100%。

表2 供试4 种杀菌剂对烟草靶斑病菌菌核形成的抑制作用 Table 2 Inhibition effect of four fungicides against sclerotium formation of R. solani

2.3 不同药剂对烟草靶斑病的田间防效

从表3看出，4种药剂施药后第9 天的防治效果，40%菌核净WP 120 g/667m2、25%嘧菌酯SC 40 mL/667m2、10%苯醚甲环唑WG 60 g/667m2及80%代森锰锌WP 200 g/667m2处理，对靶斑病的防效分别为90.59%、61.76%、52.12%和13.41%；对病斑扩展的抑制率分别为53.55%、75.10%、64.09%和7.31%。

表3 4 种杀菌剂对烟草靶斑病的田间防效Table 3 Control efficacy of four fungicides against target spot in tobacco field

3 讨论

采用生物学测定法并结合田间试验发现，抑制烟草靶斑病菌菌丝生长活性较强的杀菌剂有菌核净、嘧菌酯和苯醚甲环唑；同时发现代森锰锌、嘧菌酯和菌核净对其菌核的形成也有较强的抑制活性；田间对靶斑病防效较好的杀菌剂为菌核净、嘧菌酯和苯醚甲环唑。

抑制菌丝生长是病害防治药剂筛选的重要依据。已有诸多关于杀菌剂对立枯丝核菌敏感性研究的报道，而对烟草靶斑病菌敏感性的研究却报道较少。研究发现，菌核净抑制烟草靶斑病菌菌丝生长的EC50值为(1.72±0.25)mg/L，与汪汉成等[17]对烟草立枯病菌的敏感性(1.31±0.14)mg/L及白庆荣等[18]对高山红景天立枯病菌的敏感性(1.58±0.12)mg/L的测定结果基本一致；嘧菌酯抑制其菌丝生长的EC50值为(15.71±1.38)mg/L，与余嘉[19]对玉米纹枯病菌的敏感性(16.09±3.47)mg/L的测定结果基本一致；代森锰锌抑制其菌丝生长的EC50值为(24.77±10.99)mg/L，与张燕南等[20]对融合群水平上的棉花立枯病菌的敏感性29.15 mg/L的测定结果基本一致。伏颖等[13]采用菌丝生长速率法和抑菌圈法测定烟草靶斑病菌对10种药剂的敏感性，2种方法均发现菌核净对菌丝生长的抑制作用最强，这与该试验结果一致，进一步验证测定结果的正确性。

菌核是烟草靶斑病菌越冬和翌年初侵染的主要组织[21]，抑制菌核形成也是烟草靶斑病防治药剂筛选的重要依据。已有诸多关于杀菌剂对立枯丝核菌菌核形成的研究报道，然而对烟草靶斑病菌菌核形成研究却报道较少。研究发现，菌核净5 mg/L处理对菌核形成的抑制率高达100%，与汪汉成等[17]对烟草立枯病菌的菌核抑制率测定结果(100%)一致；嘧菌酯50 mg/L处理对菌核形成的抑制率高达100%，与KUMARI等[22]测定嘧菌酯对立枯丝核菌生防的菌核抑制率(96%)结果基本一致；苯醚甲环唑5 mg/L处理对菌核形成的抑制率高达98.59%，与汪汉成等[17]对烟草立枯病菌的菌核抑制率(97.97±2.64)%测定结果基本一致。18.75 mg/L代森锰锌处理对菌核形成的抑制率高达100%，而目前对代森锰锌抑制立枯丝核菌菌核形成的研究较少，代森锰锌质量浓度为9.38 mg/L处理的抑制率为58.35%，与汪汉成等[17]研究代森锰锌质量浓度为10 mg/L时对立枯丝核菌菌核生长抑制率为(43.58±31.87)%的结果基本一致。综上，4种杀菌剂对烟草靶斑病菌菌核形成的抑制准确可靠。

田间药效试验是检验药剂防治病害的重要环节。试验发现，嘧菌酯40 mL/667m2处理的防效可达90.59%，与马铃薯每100 kg种薯施用20 mL 25%嘧菌酯SC防控黑痣病的防效86%结果接近[5]。菌核净常被用于赤星病的防控，少有关于其对烟草靶斑病的防效评价，试验发现其田间对烟草靶斑病也具有较好的防效，在120 g/667m2处理时防效高达90.59%。苯醚甲环唑在60 g/667m2处理时防效达64.09%，与4.5 g/667m2的30%苯醚甲环唑·丙环唑SC对水稻纹枯病的防效71.43%接近[23]。代森锰锌是多作用位点杀菌剂，对包括立枯丝核菌的诸多病害具有预防作用[20，24-25]，研究发现，在靶斑病开始发生后，200 g/667m2剂量时的防效较低，为此，该药剂不适合在病害发生后使用。此外，基于烟草靶斑病病斑扩展的抑制率与基于病情指数防效评价，获得的4种杀菌剂对烟草靶斑病的防效基本一致，病情指数调查工作量较大，且易存在人为误差；相比而已，基于病斑扩展的调查方法操作简便、更为精准，可以用于今后其他药剂的田间药效评价。

4 结论

苯醚甲环唑、嘧菌酯、菌核净和代森锰锌4种杀菌剂对靶斑病菌菌丝生长和菌核形成的具有抑制作用，对靶斑病具有一定的田间防效。研究结果丰富了用于烟草靶斑病防治药剂选择的种类，考虑到菌核净和代森锰锌存在超标的风险，建议相关农药企业或烟草农药登记管理部门将苯醚甲环唑和嘧菌酯纳入烟草靶斑病防控的候选药剂。