邱泽慧，郑 尧，王锡昌,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海 201306）

我国河鲀鱼资源丰富，消费市场广阔，其中，暗纹东方鲀（）是我国养殖量最多的河鲀鱼之一，其营养价值高、风味独特。但受河豚毒素的安全性制约，养殖暗纹东方鲀只能以加工品的形式进行流通，其中，冷冻品是最主要的加工流通形式。解冻是水产冷冻品在加工消费前必不可少的处理环节，并且会显著影响产品的持水性、质构等食用品质，目前，已有许多学者对养殖暗纹东方鲀在冻藏期间发生的品质变化进行了研究，但鲜见有关解冻方式对养殖暗纹东方鲀品质影响的报道。

解冻方式包括流水解冻、静水解冻、室温解冻和冷藏解冻等传统解冻方式以及微波解冻、射频解冻、超声辅助解冻等新型解冻方式。已有许多学者研究了不同解冻方式对水产品品质的影响，如王雪松研究了5 种不同解冻方式对冷冻竹荚鱼品质的影响，发现超声波流水解冻能够较好地保持鱼肉的品质；姜晴晴等认为低温解冻方式对带鱼的破坏性最小，能较好地维持其肌肉品质；余文晖等发现静水解冻能够较好地维持金枪鱼的品质。其中，持水性与质构特性作为最重要的两个品质，直接影响了消费者对于水产品的接受程度，一般来说，消费者更愿意接受汁液损失少、肉质紧实的水产品。在解冻过程中，持水性与质构特性如硬度、咀嚼性、弹性等会发生不同程度的改变，并且相互影响，从而影响水产品的口感，且蛋白质变性也会改变产品的持水性与质构特性。现阶段，鲜有以养殖暗纹东方鲀为原料进行不同方式解冻的研究，且不同的解冻方式对冻品产生影响的研究结果也不尽相同。因此，有必要探究解冻方式对暗纹东方鲀持水性及质构特性的影响，为冻品暗纹东方鲀选取最佳的解冻方法提供理论依据。

本实验选取冷藏解冻、室温解冻、流水解冻和超声波辅助解冻4 种方法对冷冻养殖暗纹东方鲀进行解冻处理，研究不同解冻方式对河鲀鱼持水性及质构特性的影响，并尝试探寻其内在机理，旨在为冷冻水产品在解冻过程中的品质控制提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻品养殖暗纹东方鲀（质量为（278.1±22.2）g，体长为（25.1±1.1）cm）于2021年3月购自中国江苏南通中洋集团，经加工厂取内脏、去皮、液氮冷冻，置于泡沫箱中在低温状态下于24 h内运输至实验室。实验时，仅使用河鲀鱼的背部肌肉（白色肌肉部分），并置于-18 ℃的条件下冻藏备用。

5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、溴酚蓝指示剂上海阿拉丁有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）试剂、考马斯亮蓝R-250美国Sigma公司；蛋白标准品、牛血清白蛋白标准品北京索莱宝公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax分散机/匀浆机 德国IKA集团；UV-1800PC紫外-可见分光光度计 上海美谱达公司；H1850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪公司；RX6000C无纸记录仪 杭州美控自动化技术有限公司；AE-6500垂直电泳槽 日本Atto公司；TA.XT Plus型质构仪 英国Stable Micro Systems公司；F-7100荧光分光光度计 日本日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 解冻处理与解冻曲线的测定

随机取出4 组冷冻河鲀鱼块，分别按照表1所示方法进行解冻，解冻过程中将热电偶的探头插入河鲀鱼背部肌肉中心位置，实时记录河鲀鱼块中心温度，以4 ℃作为解冻终点，从-18 ℃升高到4 ℃所需要的时间即为河鲀鱼块的解冻时间。

表1 暗纹东方鲀的4 种解冻方法Table 1 Operating conditions of four thawing methods for frozen Takifugu obscurus

1.3.2 解冻损失率的测定

对1.3.1节各方式解冻鱼块进行解冻损失率计算，如式（1）所示。

式中：为解冻前河鲀鱼块质量/g；为解冻后河鲀鱼块质量/g。

1.3.3 质地剖面分析

将河鲀鱼背部肌肉切块（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）。质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）测试参考姜启兴的方法并略有修改。使用P/5平底柱形探头，测试前速率为2 mm/s，测试速率为1 mm/s，测试后速率为5 mm/s，压缩程度为50%，间隔时间为5 s，触发力为5 g，每组处理样品测8 组平行，结果去掉最高值与最低值后取平均值。

1.3.4 剪切力测定

剪切力测试的样品处理方式与TPA测试的样品相同。剪切力测试参考杨静的方法，并略作修改。使用燕尾刀片，测试前速率为5 mm/s，测试速率为1 mm/s，测试后速率为10 mm/s，压缩程度为50%，每组样品测8 组平行，结果去掉最高值与最低值后取平均值。

1.3.5 感官评定

邀请8 名经过一定感官评定培训的人员（4男4女）组成评定小组，对河鲀鱼肉进行感官评价。将解冻后的河鲀鱼背部肌肉于沸水中煮5 min，依据表2的感官评定标准进行评定，结果去掉最高和最低评分后取平均值。

表2 暗纹东方鲀肉感官评定标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of Takifugu obscurus meat

1.3.6 肌原纤维蛋白与肌浆蛋白的提取与质量浓度的测定

肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）与肌浆蛋白（sarcoplasmic protein，SP）的提取参考杨慧的方法并略作修改。在4.0 g切碎的鱼肉中加入5 倍体积预冷缓冲液（0.1 mol/L NaCl、 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），均质（10 000 r/min、30 s）2 次后离心（10 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清液作为SP溶液；剩余的沉淀加入20 mL上述缓冲液继续离心（10 000 r/min、10 min、4 ℃），重复2 次，弃去上清液，所得沉淀加入20 mL上述缓冲液，4 ℃下浸提30 min，用双层纱布过滤，滤液即为MP溶液。采用双缩脲法测定蛋白质量浓度，以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线，将所提蛋白质溶液与双缩脲试剂以体积比1∶4混合，静置30 min，于540 nm波长处测定吸光度。蛋白质溶液根据实验要求调整至合适的质量浓度。

1.3.7 蛋白质巯基含量的测定

蛋白质巯基含量的测定根据Zhang Longteng等所述的方法并稍作修改。将0.5 mL 4 mg/mL蛋白质溶液添加到4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，充分混合后将0.5 mL 0.4 mg/L的DTNB加入4.0 mL的混合物中，40 ℃水浴25 min。对照组采用0.6 mol/L的NaCl代替蛋白质溶液，于412 nm波长处测定上清液的吸光度（）。根据式（2）计算巯基含量。

式中：为蛋白质的稀释系数；为蛋白质浓度（4 mg/mL）；为摩尔吸光系数（13 600 L/（mol·cm））。

1.3.8 内源荧光强度的测定

根据Zhang Mingcheng等所述的方法并稍作修改。用0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0，0.6 mol/L NaCl）将蛋白质溶液稀释至0.3 mg/mL。发射波长范围在300～400 nm，激发波长为295 nm，扫描速率设置为1 200 nm/min。

1.3.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳

根据Laemmli所述的方法进行SDS-PAGE。将蛋白样品稀释至1.2 mg/mL，与蛋白上样缓冲液以体积比1∶4混合，将样品煮沸5 min。在质量分数5%浓缩胶和8%分离胶中进行电泳，上样量为10 μL，在80 V电压下电泳30 min，120 V电压下电泳90 min，凝胶用质量分数0.1%考马斯亮蓝R-250染色10 min，用脱色液脱色2 h。利用凝胶成像仪观察凝胶电泳结果。

1.3.10 MP的溶解度测定

根据Zhang Dong等所述的方法进行蛋白质溶解度的测定。用0.02 mol/L的PBS（pH 6.0、0.6 mol/L NaCl）将MP溶液的质量浓度调整为2 mg/mL，在高速冷冻离心机中以4 800 r/min离心10 min，取上清液，用1.3.6节方法测定蛋白质量浓度。按照公式（3）计算蛋白质溶解度。

1.3.11 微观结构的观察

根据Jiang Qingqing等所述的方法并稍作修改。将解冻后的样品分割成5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm的小块，置于体积分数为2.5%的戊二醛溶液中4 ℃下固定24 h，并用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）洗脱3 次，之后将样品脱水冻干。喷金后于扫描电子显微镜下观察鱼肉纵切面的微观结构。放大倍数为200 倍。

1.4 数据处理与分析

每组实验至少做3 组平行，得出的结果以平均值±标准差表示。所有数据均采用单因素方差分析，用SPSS软件对各平均值间的差异显著性进行分析，以＜0.05表示差异显著，并用GraphPad 7软件制图。使用XLSTAT软件运行偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLS-R）。

2 结果与分析

2.1 不同解冻方式下养殖暗纹东方鲀的解冻曲线

不同解冻方式下暗纹东方鲀的中心温度变化如图1所示，冷藏解冻、室温解冻、流水解冻和超声辅助解冻到达解冻终点所需要的时间分别为210、120、22 min和10 min。由于水的传热效率较高，因此流水解冻和超声辅助解冻所花费的时间更短，而超声波的物理效应使得水中不对称气泡破裂，产生的高速射流改善了热传递，从而提升了超声辅助解冻的解冻效率，缩短了解冻时间。

图1 不同解冻方式下暗纹东方鲀的中心温度变化Fig. 1 Changes in internal temperature of frozen Takifugu obscurus during thawing

2.2 不同解冻方式对养殖暗纹东方鲀持水性及质构的影响

2.2.1 解冻方式对养殖暗纹东方鲀解冻损失率的影响

冷冻水产品解冻后的解冻损失率是衡量冷冻水产品持水性的重要指标，同时也与水产品的经济价值密切相关。由图2可知，超声辅助解冻的解冻损失率显著高于其他处理组（＜0.05），为12.34%，而冷藏解冻的解冻损失率最低，为8.93%，这与Li Dongni等的研究结果相似。推测可能是由于采购前该养殖暗纹东方鲀经过了快速冷冻，细胞内水分子的体积发生快速变化从而产生了一定的内应力，而当解冻速率很快时，细胞体积再一次发生快速变化产生内应力，从而使细胞更容易被破坏；相反，慢速解冻则不会增大其内应力。因此，超声辅助解冻虽然缩短了解冻时间，但是超声波也使细胞内的水分子发生剧烈的物理运动，增大了内应力，导致大量的汁液流失，而冷藏解冻尽管经历了较长的解冻时间，但并不会增大细胞内应力，从而使解冻损失率相对较低。

图2 不同解冻方式对暗纹东方鲀解冻损失率的影响Fig. 2 Effects of different thawing methods on thawing loss of Takifugu obscurus

2.2.2 解冻方式对养殖暗纹东方鲀质构特性的影响

质构特性是衡量水产品品质的重要指标，并会显著影响水产品的感官特性。冷冻水产品在解冻的过程中，肌肉硬度、弹性、咀嚼性等的差异与肌肉蛋白质的变性程度密切相关。如图3A、B所示，部分解冻方式处理下养殖暗纹东方鲀的硬度与胶着性有显著性差异（＜0.05），弹性、内聚力与咀嚼性的差异并不显著（＞0.05）。经过冷藏解冻后河鲀鱼背部肌肉的硬度最大，为562.09 g，显著高于流水解冻组；胶着性为246.80，显著高于室温解冻与流水解冻组（＜0.05），这可能是因为冷藏解冻减缓了肌肉蛋白质的降解，维持了细胞间的结合力，从而较好地保护了鱼肉的质构。

剪切力作为表征质构特性的重要指标，可以反映水产品在解冻过程中肌肉蛋白质的化学结构状态。由图3C可知，冷藏解冻组的剪切力高于其他3 组，比流水解冻组高出22.31%。推测是由于在流水解冻过程中，肌肉纤维部分被破坏，蛋白质发生变性，剪切力降低，而冷藏解冻则可以较好地保护肌肉纤维结构。综合看来，冷藏解冻组肌肉组织结构受到的损伤较小，对质构特性的保护效果优于其余3 种解冻组。

图3 不同解冻方式对暗纹东方鲀质构特性的影响Fig. 3 Effects of different thawing methods on texture properties of Takifugu obscurus

2.2.3 不同解冻方式对养殖暗纹东方鲀感官品质的影响

冷冻水产品在解冻过程中，其肌肉组织会因为物理、化学等作用发生一定的改变，从而使水产品的感官特性发生改变，这直接影响消费者对解冻产品的购买欲。从表3可以看出，冷藏解冻条件下暗纹东方鲀的质地和多汁性评分分别比流水解冻条件下的评分高出了30.0%、41.7%，与解冻损失率和质构特性的结果相印证，进一步说明冷藏解冻对暗纹东方鲀鱼块的肌肉损伤较小，且能较好维持肌肉的持水性与质地。超声辅助解冻下的肌肉组织评分最高，这可能由于其快速的解冻速率维持了肌肉组织紧密完整的状态。

表3 不同解冻方式对河鲀鱼肉感官品质的影响Table 3 Effects of thawing methods on sensory quality of Takifugu obscurus

2.3 解冻方式对养殖暗纹东方鲀微观结构的影响

图4展示了不同解冻方式处理后养殖暗纹东方鲀纵切肌肉组织的微观结构。冷藏解冻后的肌纤维排列最紧密，间隙均匀，组织结构保持最完整，表明其持水性最好，与上述解冻损失分析结果相符。相较于冷藏解冻组，其余3 种解冻组肌纤维间的空隙变大，导致持水性下降；其中室温解冻组与流水解冻组的肌纤维破坏程度最大，肌纤维不再紧凑，肌肉出现了卷曲与断裂，这可能会导致蛋白质发生较大程度的变性。综上所述，冷藏解冻能够较好地维持暗纹东方鲀的持水性与质构特性，并保持其微观结构的紧密性与完整性。

图4 解冻方式对暗纹东方鲀微观结构的影响（×200）Fig. 4 Effects of thawing methods on microstructure of Takifugu obscurus (× 200)

2.4 解冻方式对养殖暗纹东方鲀蛋白性质的影响

2.4.1 MP的溶解度和巯基含量

蛋白质溶解度通常指的是蛋白质的肽键或者氨基酸侧链与水相互作用后的离散程度，因此也可作为一项反映蛋白质变性程度的指标。如图5A所示，冷藏解冻组的MP溶解度总体上显著高于其余3 种解冻组（＜0.05），且较超声辅助解冻组增加10.92%，刁小琴等同样发现冷藏解冻后猪肉的MP溶解度最大。推测原因是低温能够减弱蛋白质的交联程度，而超声波的空化效应和机械效应会促进蛋白质通过疏水作用产生聚集体，导致蛋白质发生一定程度的变性，从而使溶解度降低。因此，尽管超声辅助解冻未对暗纹东方鲀鱼块的表面肌肉组织造成较大的负面影响，但肌肉蛋白质仍然受到了一定程度的破坏。

图5 不同解冻方式对暗纹东方鲀MP溶解度（A）和蛋白质巯基含量（B）的影响Fig. 5 Effects of different thawing methods on solubility of myofibrillar protein (A) and carbonyl content (B) in Takifugu obscures

蛋白质中含有大量的巯基（—SH），在解冻过程中，巯基会被氧化成为二硫键，因此巯基含量的减少表明蛋白质发生了变性。MP为结构蛋白，与肌肉收缩有关，并影响肉制品的质构、多汁性等食用品质。SP中含有大量酶类，这些酶类与肉制品的持水性相关，并间接影响肌肉的质构特性。如图5B所示，在MP中，冷藏解冻组的巯基含量最高，为22.94 nmol/mg pro，比室温解冻与流水解冻组均高约8%，这与王雪松等的研究结果趋势一致，说明冷藏解冻对MP巯基含量的影响较小，这也与质构特性相对应。超声辅助解冻组的MP巯基含量仅次于冷藏解冻组，推测是由于超声辅助解冻缩短了解冻时间，减缓了MP巯基的氧化。在SP中，室温解冻后样品的巯基含量最低，分别比冷藏解冻、流水解冻与超声辅助解冻组低5.5%、4.5%、7.5%（＜0.05），室温解冻对SP巯基含量影响最大，而其余3 种解冻方式对SP的影响差异不显著（＞0.05）。

2.4.2 蛋白质构象

内源荧光光谱法可以通过测定蛋白质结构中的芳香氨基酸残基来表征蛋白质的三级结构，当蛋白质三级结构发生改变时，最大荧光峰位（）与荧光强度也会发生变化，的红移表示蛋白质结构展开，蓝移则表示蛋白质发生聚集。如图6所示，对于养殖暗纹东方鲀MP，4 种解冻方式下的没有显著性差异（＞0.05），但超声辅助解冻组的荧光强度明显低于其他3 种解冻组，这可能是由于超声波使得蛋白质分子产生了交联聚集，导致色氨酸残基被包埋或被氧化，这与前述结果相对应。对于SP来说，不同解冻方式处理SP的集中在335 nm附近，相比于其他3 种解冻方式，流水解冻组的蓝移，说明SP表面疏水性增大，蛋白质发生聚集。

图6 不同解冻方式对暗纹东方鲀蛋白内源荧光光谱的影响Fig. 6 Effects of different thawing methods on intrinsic fluorescence spectrum of proteins in Takifugu obscures

2.4.3 蛋白质的交联与裂解

图7为经过4 种不同解冻方式处理后MP与SP的电泳图谱。MP主要包含肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）（约200 kDa）与肌动蛋白（约45 kDa），相比于其他两种解冻方式，室温解冻与超声辅助解冻组的凝胶顶部出现了一些大分子聚合物，这表明MHC、肌动蛋白发生了一定程度的交联。经过4 种解冻方式处理后，MP的电泳图谱没有显著差异，这也可能是由于一些交联程度大的蛋白质未进入凝胶。此外，不同解冻方式造成的MHC交联或降解都会降低蛋白质的溶解度，从而影响质构特性与持水性等食用品质。而暗纹东方鲀的SP与MP构成不同，主要包含一些具有代谢功能的酶类，其分子质量主要分布在20～100 kDa，而35～48 kDa的蛋白条带较为明显，但经过不同解冻处理后样品的SP组成并没有发生较为明显的变化。

图7 不同解冻方式对暗纹东方鲀蛋白质SDS-PAGE图谱的影响Fig. 7 Effects of different thawing methods on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis pattern of proteins from Takifugu obscurus

2.5 不同解冻方式对养殖暗纹东方鲀质构及持水性的影响机制

如图8所示，使用PLS-R分析质构特性、持水性与蛋白质变性的相关关系。首先，在本研究中，对于MP而言，硬度、剪切力、质地、多汁性和、溶解度、巯基含量之间具有很强的相关性，这也意味着MP的变性会引起质构特性的下降，并对感官特性产生一定的影响，这与吴兴阁等的研究结果一致；对于SP而言，巯基含量的下降会使肌肉组织变得更加松散，且硬度、剪切力、多汁性与有很强的相关性。其次，冷藏解冻对质构特性与感官特性有强相关性，且冷藏解冻对SP的以及MP的巯基含量、溶解度与影响较大，超声辅助解冻与肌肉组织的相关性强，且影响SP的巯基含量，这也说明冷藏解冻能较好地保持肌肉的质地，减轻蛋白质变性的程度，超声辅助解冻能够较好地维持肌肉的组织。然而，由图8可知，解冻损失率与蛋白质变性的指标相关性不强，只受到SP巯基含量的影响，推测可能是因为冰晶造成的机械损伤在解冻损失中占据主导地位，这与Zheng Yao等的研究结果相似。因此综合看来，蛋白质的变性会造成质构与感官品质的下降，使水产品的质地发生改变，并间接对持水性造成影响。

图8 偏最小二乘回归相关分析Fig. 8 Partial least squares regression correlation

3 结 论

本研究中采用4 种解冻方式处理养殖暗纹东方鲀，其中，室温解冻与流水解冻组的质构特性与感官品质较差，肌肉纤维的间隙较大，蛋白质变性程度较高；超声辅助解冻的解冻效率最高，质构特性与感官评价较好，但解冻损失率最大，且超声波的空化效应和机械效应使MP受到损伤，发生一定程度的变性；冷藏解冻的解冻时间最长，但能够最大程度地保持河鲀鱼的持水性与质构特性，维持肌肉结构的紧密性与完整性，且蛋白质变性程度也较低。同时，PLS-R分析结果表明，蛋白质的变性会导致水产品的质构特性与感官特性下降，但其对解冻损失的影响较小。综上所述，4 种解冻方式中，冷藏解冻对SP与MP的破坏较小，解冻损失率最小，可以较好地维持冻品养殖暗纹东方鲀的持水性与质构特性。