刘鸣昊, 刘素彤, 尚东方, 张丽慧, 顾亚娇, 赵文霞

河南中医药大学第一附属医院 脾胃肝胆科， 郑州 450000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)进展为肝硬化、肝衰竭等终末期肝病的重要环节[1]，也是临床干预的关键节点。有研究[2]发现，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导肝脏Kupffer细胞焦亡，放大炎症反应，参与NASH的发生和进展，此过程类似于“痰湿瘀浊”在肝脏的形成和沉积。有学者[3]认为细胞焦亡可能是中医理论中痰浊、瘀血的一种微观体现。中药治疗具有多靶点的特点，在NASH的治疗中具有一定的优势。化痰祛湿活血方是第二批全国名老中医赵文霞教授根据NASH“痰湿内停、瘀血阻络、肝失条达”的主要病机而创立的，以泽泻、丹参、郁金、海藻、决明子、山楂、水飞蓟、柴胡组方。方中泽泻利水渗湿、行气消瘀为君药；丹参活血化瘀、凉血安神，郁金活血止痛、行气解郁，海藻化痰利湿、软坚消痰，共为臣药；决明子清肝明目，山楂消积散瘀，水飞蓟清热解毒，共为佐药；柴胡疏肝理气为使药，全方共奏化痰祛湿活血之功效。临床应用效果良好。课题组前期研究[4]发现，化痰祛湿活血方可通过抑制肝组织损伤，减轻炎症反应，但其机制尚不完全清晰。据此本研究将以LPS诱导RAW264.7细胞焦亡，化痰祛湿活血方含药血清干预后，采用扫描电镜观察细胞焦亡“金指标”细胞膜变化，及免疫荧光观察参与巨噬细胞焦亡发生相关的GSDMD-N含量及定位，以此揭示化痰祛湿活血方的部分疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物 SD雄性大鼠60只，SPF级，体质量(150±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物合格证号: 11400700116588; 生产许可证号: SXYK(豫)2015-0005；实验单位动物使用许可证：SXYK(豫)2017-0001。化痰祛湿活血方颗粒剂: 泽泻(批号15120135)、丹参(批号15060138)、海藻(批号15070027)、郁金(批号15060128)、决明子(批号15090036)、山楂(批号15060020)、柴胡(批号15070208)、水飞蓟(批号15070223)，由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供。多烯磷脂酰胆碱胶囊 (易善复): 赛诺菲(北京) 制药有限公司(批号5JD070)。

1.2 主要试剂与仪器 临界点干燥仪(Quorum，k850),离子溅射仪(HITACHI，MC1000),扫描电子显微镜(HITACHI，SU8100),电镜固定液(Servicebio，G1102)抗荧光衰减封片剂(solarbio，S2110)，曲拉通Triton X-100(T8200)，DAPI溶液(索拉宝，C0065)，山羊血清(S9070，索拉宝)，4%组织细胞固定液(P1110，索拉宝)，GSDMD-N抗体(affinity，DF12275)

1.3 含药血清制备 (1)中药溶液配制：将化痰祛湿活血方散装颗粒溶于适量双蒸水中，混匀后100 ℃水浴锅中煮5 min，自然冷却至室温，4 ℃保存备用。(2)多烯磷脂酰胆碱胶囊溶液配制：将胶囊去壳，药物溶于适量双蒸水中混匀，4 ℃保存备用。(3)分组和给药：将60只SD大鼠随机分为中药组、西药组、空白组。根据人与动物等效药量体质量换算方法,B种动物的剂量(mg/kg)=W×A种动物的剂量(mg/kg)，W为等效系数。计算得知大鼠化痰祛湿活血方的等效剂量为1.26 g/100 g体质量，化痰祛湿活血方的给药剂量为等效剂量(相当于临床成人用量的10倍)。中药组：灌服化痰祛湿活血方颗粒溶液(以纯水配成2.52 g/mL，灌服剂量为1 mL/100 g)。西药组：灌服多烯磷脂酰胆碱混悬液(浓度0.028 5 g/mL)。空白组：灌服去离子水，1 mL/100 g体质量。2 次/d(上午9点及下午5点)，连续3 d。最后1次灌胃结束后1 h，采用3%的戊巴比妥钠腹腔注射(0.2 mL/100 g体质量)麻醉大鼠，穿刺腹主动脉采血，离心后取上清液灭活，采用0.22 μm滤膜过滤后分装储存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 细胞培养与分组 (1)将生长良好的RAW264.7细胞分为6组，分别为空白组、模型组及化痰祛湿活血方高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组。(2)空白组给予含10%空白组血清的DMEM培养基培养，模型组给予含LPS(5 μg/mL)的10%空白组血清的DMEM培养基培养，高、中、低剂量组在模型组的基础上分别给予相应浓度的10%含药血清的培养液培养，对照组在模型组的基础上给予相应浓度的10%多烯磷脂酰胆碱含药血清，分别培养24 h和48 h后备检。

1.5 扫描电子显微镜观察各组巨噬细胞形态 将贴壁于盖玻片的细胞培养处理完成后弃培养基，用PBS漂洗后，加电镜固定液2 h，再转移至4 ℃保存。固定好的样品经0.1 mol/L磷酸缓冲液PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。再将样本放入临界干燥仪内干燥，然后紧贴于导电碳膜双面上放入离子溅射仪样品台上进行喷金30 s，扫描电镜观察。

1.6 免疫荧光染色观察巨噬细胞焦亡相关蛋白含量及定位 六孔板中弃原培养液；PBS洗涤 2 次；0.25% TritonX-100 ，室温放置10 min；PBS洗涤2次，每次3 min；滴加正常山羊血清封闭液，室温放置20 min；PBS洗涤2次，每次3 min；滴加一抗500 μL(抗体浓度按产品说明剂量配制)，放于4 ℃冰箱过夜或37 ℃孵育箱内2 h；PBS洗涤2次，每次3 min；滴加二抗500 μL(抗体浓度按产品说明剂量配制)，37 ℃孵育箱内40 min；PBS洗涤2次，每次3 min；染核，500 μL(抗体浓度按产品说明剂量配制)，37 ℃孵育箱内15 min；PBS洗涤2次，每次3 min；封片后显微镜下观察。

2 结果

2.1 化痰祛湿活血方对LPS诱导的巨噬细胞焦亡形态的影响 在扫描电镜低倍和高倍观察下发现LPS促进了巨噬细胞表面的球状突起和膜孔的形成(图1)。空白组细胞形态呈圆形，无肿胀，包膜表面光滑，无凸起，无皱褶和孔隙;模型组细胞表现形态偏圆或椭圆，细胞肿胀膨大，表面有许多气泡状突出物，大量皱褶和突起，并伸出较长伪足,细胞膜上有孔隙形成，这些变化与焦亡形态特征相符合;对照组细胞肿胀不明显，但表面许多气泡状突出物，伪足明显,细胞膜上孔隙较模型组减少;高剂量组细胞形态无肿胀接近空白组，但表面粗糙有伪足，细胞膜上未见明显孔隙;低剂量和中剂量组细胞形态椭圆或圆形，肿胀，细胞膜表面粗糙有孔隙，有伪足伸出。

2.2 化痰祛湿活血方对LSP诱导的巨噬细胞内GSDMD-N水平的影响 与空白组相比模型组 GSDMD-N阳性染色强度明显增加，对照组与中药高剂量组相较模型组GSDMD-N阳性染色强度均有减弱(图2)。

图1 电镜下巨噬细胞形态变化(低倍，×1500；高倍，×6000)Figure 1 Morphological changes of macrophages under electron microscopy (low fold, ×1500; High fold, ×6000)

注：蓝色代表PI染色结果；绿色代表 GSDMD-N染色结果。

3 讨论

Kupffer细胞与NASH致病关系密切，LPS诱导Kupffer细胞发生细胞焦亡,分泌IL-1β和IL-18诱导炎症反应是NASH的形成机制之一。研究[5]发现NAFLD患者由于饮食结构紊乱等因素，肠道内双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、肠球菌、肠杆菌等菌落数发生了明显的改变，肠源性LPS水平增高，肠壁通透性增加，LPS通过肠道-门静脉-肝脏的“肠-肝轴”循环影响肝脏，这可能是导致NAFLD向NASH发展的原因之一。LBP结合LPS进入细胞内。进入到细胞内的LPS可直接活化Caspase-11(小鼠亚型，在人身上与 Caspase-11 同源的是 Caspase-4,5)，剪切 GSDMD 形成 GSDMD-N，在胞膜上聚合形成孔道，使 IL-1β 和 IL-18 等炎症因子被释放[6]，导致肝细胞损伤。同时IL-1β 和 IL-18 会募集更多炎症细胞， 扩大肝脏炎症反应。研究[7]发现，在 NASH 模型小鼠肝脏组织中，GSDMD 和 GSDMD-N 蛋白表达明显升高，蛋氨酸/胆碱缺乏饮食喂养 NASH 模型小鼠在敲除 GSDMD 后，与野生小鼠相比脂肪变性和炎症程度明显降低，提示细胞焦亡在 NASH 发病过程中起到了重要作用。巨噬细胞在非病理状态下只表达少量 Caspase-11，当给予 LPS 刺激时， Caspase-11 表达量增加，作用于 Caspase-1 和 GSDMD-N，引起 IL-1β、IL-1α、 IL-18 的释放与Kupffer细胞焦亡。

本研究发现，LPS诱导RAW264.7细胞时，细胞表面出现球状突起和膜孔的形成。这些变化与焦亡形态特征相符合。当给予多烯磷脂酰胆碱及化痰祛湿活血方含药血清干预后发现可以减少细胞肿胀和表明突起现象，高剂量组并可明显减少细胞孔隙发生。进一步细胞免疫荧光实验证明，模型组细胞GSDMD-N阳性染色强度明显增加，证实GSDMD-N是参与细胞膜孔道形成的关键。对照组与中药组相较模型组GSDMD-N阳性染色强度均有减弱。证明药物可通过干预GSDMD-N的表达减轻细胞焦亡对肝组织的损伤。

综上所述，本研究从亚细胞水平观察了化痰祛湿活血方对巨噬细胞超微结构的影响，为中医药防治NASH的机制研究提供了实验依据。后续还会开展针对巨噬细胞焦亡的机制方面探究化痰祛湿活血方的作用靶点，为该方的临床使用提供更多实验证据。

伦理学声明：本研究方案于2021年9月16日经由河南中医药大学伦理委员会审批，批号为YFYDW2021026，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：刘鸣昊负责课题设计；刘素彤负责资料分析，撰写论文；尚东方、张丽慧、顾亚娇参与收集数据，修改论文；赵文霞负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。