罗宝浈，陈建平,2，李佳睿，陈雪花，范土贵,2，钟赛意,2，刘晓菲,2，李 瑞,2，宋兵兵,2

（1.广东海洋大学食品科技学院/广东省水产品加工与安全重点实验室/广东省海洋生物制品工程实验室/广东省海洋食品工程技术研究中心/水产品深加工广东普通高等学校重点实验室/广东省亚热带果蔬加工科技创新中心，广东 湛江 524088；2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心（大连工业大学），辽宁 大连 116034）

海藻中含硫酸基的杂多糖，不仅能提高机体免疫功能、抗肿瘤、抗氧化、防辐射及降血脂等，而且毒性小、药源丰富[1]。近年来，研究报道马尾藻中富含一类独特的结合有硫酸基团的活性多糖[2]。马尾藻资源十分丰富，在暖水和温水海域广泛分布，其中亨氏马尾藻（Sargassum henslowianumC.Agardh）和半叶马尾藻（Sargassum hemiphyllum(Turner)C.Agardh）在广东湛江硇洲岛最常见且大量生长[3]。不同种类马尾藻中岩藻聚糖的理化特性和生物活性有一定差别[4]。目前已有文献主要集中于马尾藻提取以及活性方面的应用[5-8]。然而关于这两种马尾藻岩藻聚糖的抗氧化和抗肿瘤活性的对比研究报道较少，故选择亨氏马尾藻和半叶马尾藻作为研究对象，研究其化学组成和结构、抗氧化能力和抗肿瘤活性间的构效关系，为抗肿瘤辅助药物的应用开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亨氏和半叶马尾藻，2021 年4 月采自广东省湛江市硇洲岛，将采摘的马尾藻除去烂叶、黄叶，反复用自来水冲洗干净，在60 ℃烘干保存于密封袋，后干燥储藏备用。

人肝癌HepG2细胞，由美国ATCC细胞库提供；正常人肝LO2 细胞，由中国科学院（上海）细胞库提供；胎牛血清（货号10270-106）、PBS（货号C1001050 0BT）、DMEM 高糖培养基（货号C11995500BT）、0.25%胰蛋白酶溶液（货号25200072）和青霉素-链霉素双抗溶液（货号15140122），均购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司旗下Gibco 品牌；DPPH 自由基清除能力测试盒（货号A153-1-1），购于南京建成生物科技发展有限公司；总抗氧化能力检测（FRAP法）试剂盒（货号S0116），购于碧云天生物技术有限公司；L-岩藻糖（货号CCFD200617）、岩藻聚糖硫酸酯（货号S11142）、葡萄糖醛酸标准品（货号B25302）、MTT（噻唑蓝）（货号S19063）均购于上海源叶生物科技有限公司；DMSO（二甲基亚砜）（货号R012316）、体积分数5%苯酚溶液（货号R094001），购于上海易恩化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

AUW120 电子天平，日本岛津公司；XRDKQ-500DB 型数控超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；VarioskanFlash 多功能酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；双光束紫外可见分光光度计，北京谱析通用仪器有限责任公司；DZF-6050 真空干燥箱，上海一恒科学有限公司；HL-6 数显恒温水浴锅，常州奥华仪器有限公司；Eppendorf5810R 冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；FD8508 真空冷冻干燥机，韩国ilshin 公司；EYELA 旋转蒸发仪，日本EYELA 公司。

1.3 方法

1.3.1 半叶和亨氏马尾藻岩藻聚糖的提取 参考蔡璐[9]方法提取马尾藻岩藻聚糖：马尾藻经粉碎和过筛（孔径0.18mm）后，按料液质量（g）体积（mL）比（下称“料液比”）1∶30配成马尾藻的水溶液，并将其放置于80 ℃恒温水浴锅中浸提3.5 h。浸提液经超声处理（60 ℃、350 W）50 min、离心（4 000 r/min）20 min和浓缩后得到样品浓缩液。按V（浓缩液）∶V（无水乙醇）=7∶3 的比例在浓缩液中加入无水乙醇，24 h后离心得到上清液，继续加无水乙醇至体积分数为80%，24 h 后离心得到所需沉淀。用丙酮和无水乙醇交替洗涤沉淀各2次，然后用少量水溶解沉淀，以V（多糖溶液）∶V（Sevage 试剂）=5∶1 的体积比加入Sevage 试剂[V（正丁醇）∶V（氯仿）=1∶4]，剧烈振荡1 h，于分液漏斗中静置分层后，除去沉淀，重复加入Sevage过程6次，直至没有变性蛋白出现。透析48 h并真空冷冻干燥得到亨氏马尾藻岩藻聚糖（Fh）和半叶马尾藻岩藻聚糖（Fb），得率分别为（5.10 ±0.34）%和（5.80±0.86）%。

1.3.2 Fh和Fb的理化性质和结构表征测定

1.3.2.1 化学组成分析 测定总糖含量采用苯酚-硫酸法[10]，以岩藻糖为标准糖；测定L-岩藻糖含量采用Dische 比色法[11]；测定糖醛酸含量采用咔唑比色法[12]，以葡萄糖醛酸计；测定硫酸根含量采用明胶比浊法[13]。

1.3.2.2 全波长紫外-可见光谱（UV-VI）扫描 将马尾藻岩藻聚糖样品配制成质量浓度1.0 mg/mL 水溶液，用紫外可见光谱仪进行扫描，扫描波长190～600 nm；扫描速度中速；采样间隔1.0。

1.3.2.3 红外光谱分析 参照Jia 等[14]的方法，先将溴化钾用玛瑙研钵研磨成更细的粉末，并在红外灯下干燥4 h，以溴化钾压成1 mm左右厚半透明薄片做空白，以样品与溴化钾混合研磨制成压片，于500～4 000 nm区间进行红外扫描。

1.3.3 Fh和Fb的体外抗氧化能力测定

1.3.3.1 对DPPH 自由基清除能力测定 将马尾藻岩藻聚糖Fh、Fb 稀释成不同质量浓度梯度：100、200、300、400 和500 μg/mL，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定其DPPH自由基清除能力。

1.3.3.2 总抗氧化能力测定（FRAP法）按照总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP 法)中的使用说明[15]，配置1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mg/mL 不同质量浓度梯度的马尾藻岩藻聚糖Fh、Fb溶液。

1.3.4 Fh和Fb的体外抗肿瘤活性测定

1.3.4.1 人肝癌HepG2 细胞的培养 HepG2 细胞经复苏后置于含体积分数10%胎牛血清和1%双抗溶液的DMEM 高糖培养基中，并将细胞培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中静置培养，待细胞汇合度在70%～80%时即可进行传代，取生长良好并处于对数生长期细胞用于下述实验。

1.3.4.2 MTT 检测Fh 和Fb 抑制人肝癌HepG2 和 人正常肝细胞LO2 细胞生长的效果 参照Chen 方法[16]，将100 μL 的HepG2 细胞（2 × 104个/mL）和LO2 细胞（5 × 104个/mL）接种于96 孔板，放入37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养24 h。加入不同浓度马尾藻岩藻聚糖各100 μL，使岩藻聚糖样品终质量浓度为2、4、8 mg/mL，另设空白组（只加培养液）和对照组（只加细胞悬浮液），继续培养72 h后，避光加入5 mg/mL 的MTT，每孔20 μL，置于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中避光孵育4 h，用注射器移去每孔的上清液后，加入150 μL的DMSO，震荡10 min，570 nm 测D值。以空白对照组的D值为100%，计算细胞存活率，计算公式如下：

式中，D0为空白组光密度；Di为不同处理组光密度；Dj为对照组光密度。

1.3.5 数据统计与分析 每组实验重复3次，实验数据以平均值±标准差表示。应用SPSS26.0软件进行单因素ANOVA 显著性差异分析，多重比较采用LSD 法，显著性水准为α=0.05，P＜0.05 表示差异显著。图表的绘制采用Origin2021软件。

2 结果与分析

2.1 Fh和Fb的化学组成

由表1 可知，Fb 和Fh 均是含有L-岩藻糖、硫酸基并伴有部分糖醛酸的杂多糖。而且，Fb 的总糖（75.33 ± 3.99）%、L-岩藻糖（15.63 ± 3.37）%和硫酸基的含量（29.16±0.86）%均高于Fh。

表1 Fh和Fb的化学组成Table.1 Chemical compositions of Fh and Fb%

2.2 Fh和Fb的紫外-可见光谱

由图1可知，Fh和Fb在260 nm 处均无吸收，表明Fh 和Fb 均不含核酸；Fh 和Fb 在280 nm 处均有较小吸收峰，说明重复去除蛋白6 次后，Fh 和Fb 仍含少量蛋白，可能是蛋白通过复杂的键与多糖相连[17]，Sevage 试剂无法将其脱除，为节约能源，实验以脱除6 次为好，此时，蛋白去除率可达到较高的同时，多糖含量始终保持在平稳状态，对多糖没有造成破坏，可看出，Sevage 法去蛋白是一种柔和去蛋白方法，可用作去除多糖中的蛋白。

图1 Fh和Fb的紫外-可见光谱（UV-VI）图谱Fig.1 UV-visible spectra(UV-VI)of Fh and Fb

2.3 Fh和Fb的红外光谱

由图2 可知，Fh 和Fb 在3 600～3 200 nm 有羟基O—H 伸缩振动吸收峰和在3 000～2 800nm 有较弱的糖类甲基C—H伸缩振动峰，说明Fh和Fb含多糖。此外，Fh 和Fb 在1 740～1 680 nm 处出现的吸收峰均是羧基的C=O 非对称伸缩振动，表明Fh 和Fb 含有羧基基团，可能含有一定量的糖醛酸[18]。在1 450～1 420 nm和1 250～1 200 nm处分别有C—H伸展与变形振动和硫酸基S=O的伸缩振动，表明Fh和Fb 均为硫酸多糖。在833 nm 处有一强吸收峰，这一位置既是α-糖苷键的特征吸收,也是C—O—S振动的特征吸收。在906 nm 处有一小峰，此为β-糖苷键的特征吸收，而在此位置的吸收不明显。表明Fh、Fb和岩藻聚糖标品的糖苷键类型都以α-糖苷键为主，并有少量的β-糖苷键[19]。岩藻聚糖标品在850 nm处有吸收峰，表明其硫酸根连接在C4位处于直立键位置。而Fh 和Fb 分别在825 nm 和819 nm处有吸收峰，表明其硫酸根均连接在糖C2 或C3 位处于平伏键位置的[9]。

图2 Fh和Fb的FT-IR光谱Fig.2 FT-IR spectra of Fh and Fb

2.4 Fh和Fb的体外抗氧化测定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力测定 由图3 可知，Fh和Fb 均具有一定的DPPH 自由基清除活性。随着Fh 和Fb 的质量浓度升高，清除率总体呈上升趋势。且在300～500 μg/mL范围内，Fb对DPPH 自由基清除能力高于Fh。

图3 Fh和Fb对DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging abilities of Fh and Fb

2.4.2 总抗氧化能力测定 由图4可知，在1～5 mg/mL内，Fh 和Fb 的总抗氧化能力呈剂量依赖性，随着质量浓度增加而增加。且在实验质量浓度范围内，Fb的总抗氧化能力明显强于Fh。

图4 Fh和Fb的总抗氧化能力测定Fig.4 Total antioxidant capacities of Fh and Fb

2.5 Fh和Fb对HepG2 和LO2细胞存活率的影响

由图5 可知，与空白对照组相比，Fh 和Fb 在浓度2～8 mg/mL 内对人肝癌HepG2 细胞和人正常肝LO2 细胞均有抑制效果，但是对HepG2 细胞的抑制效果强于LO2 细胞，表明Fh 和Fb 具有细胞选择性。同时，随着Fh 和Fb 质量浓度增加，HepG2 的细胞存活率呈现出下降趋势，表明Fh 和Fb 抑制HepG2 细胞的生长均具有良好的剂量效应。当Fb 和Fh 质量浓度达到8 mg/mL 时，其对HepG2 细胞的存活率（%）分别从对照组的100%降低到（21.17±2.54）%、（27.21±3.69）%，说明Fb对HepG2细胞的抑制效果要强于Fh。

图5 Fh(a)和Fb(b)对HepG2和LO2作用72 h的细胞存活率Fig.5 Effects of Fh and Fb on the cell viabilities of HepG2 and LO2 after 72 h treatment

3 讨论

采用超声波辅助热水浸提、乙醇分级沉淀、Sevage 法脱蛋白后从马尾藻中提取得到岩藻聚糖。据国内外文献报道，大部分褐藻中的岩藻聚糖均由多种糖残基构成[5,20]。富士川龙郎等[21]先后从21 种褐藻中提取岩藻聚糖，其中岩藻糖质量分数（12.9%～46.2%）、硫酸基质量分数（14.3%～38.1%）和糖醛酸质量分数（0.62%～20.2%）均不相同。本研究提取的Fh 和Fb 的化学组成分析表明，Fb 和Fh 均是含有L-岩藻糖、硫酸基并伴有部分糖醛酸的杂多糖。Fh 和Fb 的差别主要在岩藻糖及硫酸根的含量上，Fb 的总糖（75.33 ± 3.99）%、L-岩藻糖（15.63 ±3.37）%和硫酸基的质量分数（29.16 ± 0.86）%均比Fh 高。进一步红外光谱分析表明，组分Fh 和Fb 都含有多糖的特征吸收峰，且都含有羧基和硫酸基，表明均为含有糖醛酸的硫酸多糖。不同的是，岩藻聚糖标品的硫酸根连接在C4 位处于直立键位置。本研究发现Fh、Fb 的硫酸根都是连接在C2 或C3 位处于平伏键位置的，这证实了C2与C4是SO42-基团取代的主要链接位置[22-23]。

Rocha 等[24]研究发现，墨角藻多糖具有很强超氧阴离子自由基清除能力，并且多糖的抗氧化作用强弱与其硫酸基含量呈正相关。本研究实验结果也发现，硫酸根含量较高的Fb的抗氧化活性要强于Fh，这证实多糖的抗氧化活性受硫酸根含量影响。这可能是由于硫酸基团的引入改变了多糖的糖链构象进而提高其水溶性，使其生物活性增强[25]。同时，研究发现，从日本昆布（Eisenia bicyclis）分离出的岩藻多糖对DLD-1 结肠癌和SK-MEL-28 黑素瘤细胞系均表现出显著抗肿瘤活性，进一步研究发现该岩藻多糖只含有岩藻糖，且其硫酸根含量高达32.3%[26]。本研究实验结果也表明，L-岩藻糖和硫酸基含量较高的Fb 对HepG2 肝癌细胞的抑制效果强于Fh，这验证了岩藻聚糖的抗肿瘤活性与L-岩藻糖、硫酸基含量呈正相关。

研究发现，肿瘤的发生和发展与机体的氧化状态有关，当机体中自由基过量产生时，会引起蛋白质变性、酶失活、生物膜结构损伤、细胞解体乃至机体病变和死亡，最终引发癌症等多种疾病[27]。故摄入外源性的抗氧化剂，维持机体内自由基动态平衡，能有效预防癌症发生。研究发现，茶叶中茶多酚具有卓越的抗氧化能力，使它能在由活性氧自由基引起的许多疾病中发挥保护作用，例如癌症[28]。本研究也表明，相比Fh，具有更强抗氧化能力的Fb组分表现出更强抗肿瘤活性，这证实抗氧化与抗肿瘤活性是密切相关的。

4 结语

本研究从半叶和亨氏马尾藻中提取Fb 和Fh，并对其进行理化性质和抗氧化抗肿瘤进行比较研究，发现Fb的总糖（75.33±3.99）%、L-岩藻糖（15.63±3.37）%和硫酸基（29.16±0.86）%的质量分数均高于Fh。且红外光谱分析得出Fh和Fb均含O-H、C-H等多糖特征官能团、S=O 活性特征官能团，以α-糖苷键为主，并有少量β-糖苷键，且其硫酸根均连接在糖C2或C3位即处于平伏键位置。体外抗氧化结果表明，Fb 的DPPH 自由基清除能力和总抗氧化能力均强于Fh，并呈剂量依赖性，表明Fb 抗氧化活性强于Fh。MTT 结果表明，随着Fh 和Fb 质量浓度增大，HepG2 细胞存活率呈下降趋势，且当Fb 和Fh 质量浓度为8 mg/mL 时，HepG2 细胞的存活率分别为（21.17 ± 2.54）%、（27.21 ± 3.69）%，说明Fb 抗肿瘤活性较Fh 略好，这可能是由于Fb 的L-岩藻糖和硫酸根含量较高。综上可知，不同组成和结构的岩藻聚糖具有不同的生物活性，为进一步研究马尾藻岩藻聚糖的构效关系提供一定的理论基础。