丛凯平，李婷婷,2*，吴彩娥,2，范龚健,2，王佳宏,2，索安迪

(1. 南京林业大学轻工与食品学院，南京 210037; 2. 南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，南京 210037)

桑(MorusalbaL.)属桑科，史载于《神农本草经》，具有疏散风热、清肺润燥的功能。桑叶别名“铁扇子”，历代中医药书籍中记载其能够治疗消渴症[1]。研究发现，桑叶中存在大量的生物碱、多糖和黄酮等活性物质，不仅可用于治疗Ⅱ型糖尿病、肥胖症等疾病[2]，还被应用于抗炎、抗病毒和抗肿瘤转移等多个医疗领域[3]。

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)[4]是一种多羟基生物碱类型化合物，具有较好的抑制糖苷酶活性，其亲和性比麦芽糖、蔗糖强，主要表现在小肠内与α-葡萄糖苷酶结合，对二糖与葡萄糖苷酶的反应存在着竞争性遏制，能够降低麦芽糖和蔗糖等二糖在小肠中的水解度，抑制人体肠道对单糖的吸收，有效降低人们进食后的血糖水平[5]。

目前，用来检测桑叶中DNJ含量的方法有很多。例如，王建山等[6]采用液相串联质谱法分析DNJ含量，但成本高，应用普及性低；李继文等[7]采用柱前衍生化法测定DNJ含量，但操作烦琐，稳定性差；陈智毅等[8]采用离子色谱法测定DNJ含量，缺点是电化学检测器选择性低，灵敏度较低。为此，笔者建立了一种高效可靠且成本较低的快速检测桑叶中DNJ含量的方法，比较不同地域与品种的桑叶中DNJ含量，并研究其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及类型。从含量、对α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制类型多方面研究桑叶DNJ，这对提高我国桑的经济效益和促进桑的产业升级具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3种不同地域桑叶(沁县桑叶、阳城桑叶和韩国桑叶)均为普通饲蚕桑，分别购自山西沁县、山西阳城和韩国桑叶基地，3种不同品种桑叶(果桑、叶桑和蛋白桑)均购自山西沁县桑叶基地。DNJ，色谱纯(纯度98%)，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；732型阳离子树脂，购自北京索莱宝公司；α-葡萄糖苷酶，购自上海源叶公司；葡萄糖测定试剂盒，购自海荣盛公司；乙醇、碳酸钠等均为国产分析纯。

1.2 桑叶中DNJ含量快速检测方法的建立

1)原料预处理。将干制桑叶粉碎后过80目(孔径为0.178 mm)筛。取一定质量桑叶粉末，以质液比1∶20(g∶mL)加入60%(体积分数)的乙醇溶液，超声辅助提取；离心后保留上清液。再次以质液比1∶30向沉淀中加入80%的乙醇溶液，4 ℃静置过夜；离心后取上清液，合并上清液低温减压除醇，并溶于水中；以0.5 mol/L的氨水为洗脱液，过732型钠离子交换树脂，流速为1.5 mL/min，洗脱液减压浓缩冷冻干燥备用。经测定，上述样品中DNJ的纯度为85%左右，以下简称为桑叶提取物。

2)色谱条件。色谱柱为Waters HILIC Silica Column(粒径为5 μm，内径×柱长为4.6 mm×150 mm)；柱温30 ℃、流速0.2 mL/min、进样量10 μL；流动相为乙腈和水(体积比85∶15)；蒸发光检测器漂移管温度52 ℃、氮气压力275.8 kPa、增益60；喷雾器模式为冷却。

3)DNJ标准曲线的绘制。准确称量1 mg的DNJ标准品，用乙腈和水(体积比1∶1)溶液定容于10 mL容量瓶中，摇匀，获得质量浓度为100.0 μg/mL 的DNJ对照品溶液；用乙腈和水(体积比1∶1)稀释成质量浓度为1.0～12.0 μg/mL的梯度溶液，过0.22 μm滤膜，取10 μL进行色谱分析。标准曲线方程为y=1×106e0.05x，决定系数R2=0.999 4。

4)方法学考察。灵敏性检测，分别取1，2，4，8和10 μL的100.0 μg/mL标准品溶液，按上述色谱条件进行分析，依据所得色谱图确定DNJ的最低检测量及最佳峰型对应进样量，考察该方法的灵敏性；精密度检测，取10.0 μg/mL标准品溶液，连续进样5次，每次10 μL，记录色谱峰面积并且计算标准偏差，计算该方法的精密度；稳定性检测，取10.0 μg/mL标准品溶液，依次放置0，2，4，6，8和10 h，进样10 μL，记录色谱峰面积并且计算标准偏差，考察该方法的稳定性；重现性检测，取10.0 μg/mL 标准品溶液，连续进样5次，每次10 μL，记录色谱峰面积和保留时间并且计算标准偏差，考察该方法的重现性。

1.3 桑叶中DNJ含量的测定

用乙腈和水(体积比1∶1)将上述桑叶提取物定容于5 mL容量瓶中，作为供试品溶液；过0.22 μm膜，按上述色谱条件进行色谱分析。

1.4 α-葡萄糖苷酶反应体系的优化

根据α-葡萄糖苷酶对反应体系的要求，选择反应底物浓度、酶用量和反应时间3个反应条件进行单因素实验，建立最优反应体系。

1)最适底物浓度：建立0.5 mL的反应体系，反应底物为0.2 mL蔗糖溶液，反应底物质量浓度设置为0，1，2，4，8，16，32，36和40 mg/mL，37 ℃水浴10 min，加入0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴60 min，65 ℃水浴加热2 min终止反应。使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖含量。

2)最适酶用量：建立0.5 mL的反应体系，反应底物为0.2 mL的32 mg/mL蔗糖溶液，37 ℃水浴10 min，分别加入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴60 min，65 ℃水浴加热2 min终止反应。使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖含量。

3)最适反应时间：建立0.5 mL的反应体系，反应底物为0.2 mL的32 mg/mL蔗糖溶液，37 ℃水浴10 min，加入0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，分别在37 ℃下水浴0，10，20，30，40，50，60，80和100 min，65 ℃水浴加热2 min终止反应。使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖含量。

1.5 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率

使用磷酸钾缓冲液将上述桑叶提取物样品定容至50 mL，得到20.0 mg/mL的桑叶提取物溶液，并将其稀释成质量浓度为1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 和20.0 mg/mL的一系列梯度溶液。按照上述最佳反应体系，加入0.2 mL的32 mg/mL的蔗糖溶液，再加入0.1 mL样品，37 ℃水浴10 min，加入0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴60 min，65 ℃水浴加热2 min终止反应。使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖含量，并根据公式计算桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制率，公式如下：

(1)

式中：A1为505 nm下不添加抑制剂的吸光值；A2为505 nm下添加酶抑制剂的吸光值；A0为空白对照组505 nm下的吸光值。

1.6 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型

以5.0 mg/mL沁县桑叶提取物为例，以磷酸缓冲液为空白对照，观察当α-葡萄糖苷酶的酶活在0～29.0 U/mL范围内在505 nm下的吸光值。采用酶反应动力学的分析方法，α-葡萄糖苷酶的酶活为横坐标，反应速率为纵坐标作图，通过观察直线是否通过原点，判断该反应是可逆性抑制还是不可逆性抑制：若通过原点，则为可逆性抑制；若不通过原点，则为不可逆性抑制。

控制α-葡萄糖苷酶活为0.4 U/mL，加入等体积的5.0 mg/mL沁县桑叶提取物，以磷酸缓冲液为空白对照，观察当底物浓度在0～0.50 mol/L变化过程中，各反应体系505 nm下的吸光值(A505)。采用Lineweaver-Burk双倒数法作图[9]，以蔗糖浓度的倒数(1/S)为横坐标，反应速率的倒数(1/V)为纵坐标，观察两直线的交点，判断该反应抑制作用类型为竞争性抑制还是非竞争性抑制：若交点在纵轴上，则为竞争性抑制；若在横轴上，则为非竞争性抑制。具体计算公式如下：

(2)

式中：S为蔗糖浓度，mol/L；Vmax为最大反应速率，mol/(L·min)；Km为米氏常数。

1.7 数据分析

实验数据差异显著性检验采用SPSS 22.0软件分析，均以平均值±标准差表示。采用Tukey’s检验，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

笔者建立HPLC-ELSD的方法来快速检测桑叶中DNJ的含量，通过峰面积和保留时间来考察该方法的精密度、稳定性和重现性、出峰时间准确性，经过5次平行实验，其相对标准偏差(RSD)分别为0.21%，0.19%，0.19%和1.44%，均小于 2.00%。由此可知，该方法的精密度、稳定性和重现性均较好。DNJ标准品和桑叶提取物的色谱图见图1。该方法检测DNJ的最低检测量为1 μL，较为灵敏，当进样量为10 μL时峰形最好，说明该方法灵敏度可达到该实验需求，可靠性高。

图1 DNJ标品和桑叶提取物的高效液相色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of DNJ and the extract mulberry leaves

2.2 桑叶中DNJ的含量

不同地域和不同品种桑叶中DNJ的含量如图2所示。不同地域桑叶中DNJ的含量由高到低分别为沁县桑、阳城桑和韩国桑，依次为2.419，1.937和1.205 mg/g，沁县桑叶与阳城桑叶、阳城桑叶与韩国桑叶之间均具有显著性差异(P<0.05)。这说明不同地域桑叶中DNJ的含量不同，这一结论与陆城宇等[10]的研究结论一致。由此推测，影响桑叶中DNJ含量的因素可能与产地气候、土壤条件等有关，如温度、湿度、降水量和施肥情况等。

不同品种桑叶中DNJ的含量由高到低分别为果桑、蛋白桑和叶桑，DNJ含量依次为2.694，2.408和1.623 mg/g，果桑和蛋白桑之间没有显著性差异(P>0.05)，蛋白桑和叶桑之间具有显著性差异(P<0.05)，且果桑和蛋白桑中DNJ含量均远高于陕西周至‘育711号’桑树(1.840 mg/g)[11]，是选育高DNJ含量的优良品种。

注：不同小写字母表示不同地域桑叶中DNJ含量具有显著性差异(P<0.05)；不同大写字母表示不同品种桑叶中DNJ含量具有显著性差异(P<0.05)。图2 不同地域/不同品种桑叶中DNJ的含量Fig. 2 The contents of DNJ in mulberry leaves in different regions/different wood species

2.3 α-葡萄糖苷酶反应体系的优化

底物浓度、酶用量和反应时间对α-葡萄糖苷酶反应体系的优化结果如图3所示。由图3a可知，随着底物蔗糖质量浓度的增加，505 nm下的吸光值呈现先上升后平稳的趋势。当蔗糖质量浓度为32和36 mg/mL时，两者差异不显著(P>0.05)。因此，选择32 mg/mL为此反应体系的底物质量浓度。由图3b可知，随体系中酶用量的增加，505 nm下的吸光值先上升后平稳，当酶用量超过0.4 U/mL 时，505 nm下的吸光值没有明显改变，且酶用量为0.4和0.5 U/mL所对应的吸光值差异不显著(P>0.05)。因此，选择0.4 U/mL为最适酶用量。由图3c可知，反应时间大于60 min时，505 nm下的吸光值基本保持不变，当反应时间分别为60和80 min时，差异不显著(P>0.05)。因此，选择60 min为此反应体系的最佳反应时间。

图3 底物浓度、酶用量和反应时间对反应体系中A505 nm的影响Fig. 3 Effects of substrate concentration, enzyme dosage and time on A505 nm of the reaction

2.4 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制剂可以用于Ⅱ型糖尿病的治疗，通过抑制淀粉等碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下转化为葡萄糖的过程，降低人体血液中的血糖值[12]。不同品种、不同地域桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率如图4所示。由图4可知，6种桑叶提取物均可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，这表明6种桑叶提取物都具有一定的降血糖作用，但它们之间存在差异。6种桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率在0～12.5 mg/mL范围内随质量浓度的增大而迅速升高，大于12.5 mg/mL后抑制率随质量浓度上升趋势较为平缓。当桑叶提取物质量浓度大于12.5 mg/mL时，不同品种桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率由高到低依次为蛋白桑、叶桑和果桑(图4a)，蛋白桑提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为86.0%。当桑叶提取物质量浓度大于12.5 mg/mL时，不同地域桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率由高到低依次为沁县桑、阳城桑和韩国桑(图4b)，沁县桑提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为89.0%，为6种桑叶提取物中最高，仅略低于“降糖神茶”青钱柳的多糖提取物[13]。

注：不同大写字母代表同种桑叶不同质量浓度桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率具有显著性差异；不同小写字母代表同种质量浓度不同种桑叶对α-葡萄糖苷酶抑制率具有显著性差异。图4 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig. 4 Inhibitory effect of extract from mulberry leaf on α-glucosidase

沁县桑叶中DNJ的含量比果桑低，但是沁县桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率更高，可能与桑叶提取物中残余多糖、黄酮等其他活性物质有关。例如，桑叶中芦丁也具有一定的调节糖脂代谢的作用[14]，所以，桑叶提取物的降血压效果可能是几种活性物质的协同作用，但是DNJ占主导地位。该结论与胡玉城等[15]得出的结论基本一致。

2.5 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型

当无抑制剂时，速率直线通过原点；当存在不可逆性抑制剂时，其速率直线不通过原点。然而，当可逆性抑制剂存在且量恒定时，可得到一条直线，特点为通过原点而斜率较低[16]。由桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线(图5)可知，桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型是可逆性抑制。

图5 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线Fig. 5 Inhibitory kinetic curves of extract from mulberry leaves on α-glucosidase

通过Lineweaver-Burk双倒数作图法作图，判断两条直线的交点：若交点出现在纵轴上，则为竞争性抑制剂；交点出现在横轴上，则为非竞争性抑制剂[17]。桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制双倒数图见图6。由图6可知，交点出现在横轴上，说明其抑制作用类型是非竞争性抑制。

图6 桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制双倒数图Fig. 6 Lineweaver-Burk plots of reversible inhibition of extract from mulberry leaves on α-glucosidase

3 结 论

笔者建立HPLC-ELSD的方法用来快速测定桑叶中DNJ的含量，经验证，该方法快捷简便、结果可靠，具有较高的精密度及准确性和较好的重现性，具体结论如下：

1)通过测定6种桑叶中的DNJ含量，发现不同地域和不同品种桑叶中DNJ含量均存在差异，这说明，桑叶的产地和品种选育都会影响DNJ含量。在不同品种桑叶中，果桑中DNJ含量最高，为2.694 mg/g；在不同地域桑叶中，沁县桑叶最高，为2.419 mg/g。

2)通过优化底物浓度、酶用量和反应时间，建立了α-葡萄糖苷酶的最佳反应体系；在上述反应体系下比较桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，沁县桑叶最佳，其酶抑制率可达89.0%，桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率与桑叶中DNJ含量顺序基本相同，但是略有差异。可能的原因是与桑叶提取物中残留的其他活性物质相关。

3)以沁县桑叶DNJ为例，探究发现桑叶DNJ对α-葡萄糖苷酶抑制反应类型为可逆性非竞争性抑制。通过研究DNJ在桑叶中的含量、对α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制类型，为日后桑叶DNJ的高效利用提供理论基础。