孙海燕， 田 芸， 郝丹青， 王 瑞， 裴金金， 陈 琛， 李新生，2

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000； 2.陕西理工大学/陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中 723000；3.国家农产品保鲜工程技术研究中心秦巴地区保鲜工作站，陕西汉中 723000；4.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳 550000)

天麻(Bl.)又称赤箭、离母、神草等，属于兰科植物，广泛分布于秦巴山区，是一种传统的名贵中药材。天麻的主要有效成分是天麻素及其苷元、天麻多糖，对头痛失眠等症状有较好的治疗作用。目前，天麻主要作为药材使用，在市面上以干品居多，新鲜样品较少，这是因为天麻的采收时间较短，新鲜天麻容易溃烂，不易保鲜，一般仅可自然放置5～7 d。传统的天麻贮藏大多采用保鲜剂、真空包装、低温冷藏等方法，在一定程度上可以延长天麻的保鲜时间。目前，国内外对天麻保鲜的研究较少，国内已有的报道主要集中于鲜食天麻贮藏工艺及鲜食天麻与传统干制天麻贮藏方法的比较，也有一些报道是关于天麻失质量率、可食率、口感、硬度、色度等进行的研究。至今，天麻软化相关酶是否会影响其后续保鲜效果尚仍不清楚。天麻在采收后仍具有活性，在其贮藏期间会逐渐软化，活性物质会被降解，不利于保鲜；天麻软化是一个非常复杂的发育调控过程，包含一些生理生化反应，包括细胞壁的降解、内含物的变化、呼吸速率的变化等，可能有多种软化相关酶参与调控。果胶裂解酶(PL)是一种通过降解果胶使果实软化的酶，可以随机裂解高等植物的中胶层和初生细胞壁，主要功能是在果实成熟过程中参与果胶结构的裂解以达到软化果实的目的；果胶甲酯酶(PME)能够催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化，可以使植物细胞壁中的果胶多糖降解；过氧化物酶(POD)隶属于氧化还原酶类，广泛分布于大自然中，是造成植物木质化的关键酶之一；木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中，是一种催化活性很强的蛋白水解酶；组织蛋白酶是蛋白酶类的一种，其主要功能是降解蛋白质。

本研究所用天麻取自陕西省汉中市南郑县青树镇，采收当天运回实验室，筛选无损伤且大小均一的天麻。成熟天麻为黄褐色块茎，取新鲜天麻，清洗干净后切成块状，采用茶多酚涂膜、超高压处理、茶多酚涂膜+超高压处理3种方式处理，用聚乙烯保鲜袋保存于4 ℃冰箱中，以备后续试验使用。本试验以3种不同处理方式处理的天麻样品为材料，首先进行表型分析，然后提取样品RNA，进行反转录后用qPCR检测天麻软化调控相关酶的表达规律，为进一步从分子水平揭示天麻软化机制和保鲜效应奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2019年3月于陕西省汉中市略阳县采挖新鲜天麻，当天运回实验室后，用清水清洗、晾干、去皮后切成1 cm厚的片状，用3种不同方式处理(茶多酚涂膜、超高压、茶多酚涂膜+超高压)后，各个处理均称取(250±2) g装入聚乙烯塑料袋中，封口后存放于4 ℃冰箱中。

1.2 主要试剂及仪器

总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(TaKaRa)、qPCR试剂盒、SYBR Premix Ex[宝生物工程(大连)有限公司，TaKaRa]；三氯甲烷、异丙醇、75%冷乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)水[上海科拉曼试剂有限公司]；TRIzol(西安热默尔生物科技有限公司)。PCR扩增仪(美国伯乐公司)、恒温水浴锅(上海精密仪器仪表有限公司)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、电子分析天平(奥豪斯公司)、蛋白核酸分析仪(美国Thermo公司)、电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)、凝胶成像(英国Syngene公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 选取新鲜天麻，分别用3种方式(茶多酚涂膜、超高压、茶多酚涂膜+超高压)进行处理。(1)茶多酚涂膜。在新鲜天麻表面均匀喷涂1.5%茶多酚保鲜液，阴凉避光处晾干后，装入聚乙烯袋中保存。(2)超高压处理。将新鲜天麻装入聚乙烯袋中，封口后在20 ℃、300 MPa条件下超高压处理10 min。(3)茶多酚涂膜+超高压处理。在新鲜天麻表面均匀喷涂1.5%茶多酚保鲜液后，于阴凉避光处晾干，再将其装入聚乙烯袋内，封口后在20 ℃、300 MPa条件下超高压处理10 min。

1.3.2 取样及表型观察 每7 d取样1次，每次取出2片鲜切天麻，观察样品表型差异并拍照记录。再将样品切成小块，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 RNA的提取 提取用不同方式处理的天麻样品RNA的具体步骤如下：(1)取2 mL离心管，加入1 mL TRIzol，将试验样品和研钵(160 ℃灭菌)从-80 ℃冰箱中取出，先向研钵中加入液氮预冷，再将样品放入研钵中研磨，边研磨边补充液氮，研磨至粉末状，用药匙将粉末加入离心管中，做好标记；(2)室温静置10 min使粉末充分裂解，于12 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，去除组织碎片，小心吸取上清(红色)至新的2 mL离心管中；(3)向离心管中加入 200 μL 三氯甲烷(TRIzol体积的1/5)，盖紧离心管盖，剧烈振荡15 s，待液体充分乳化后，冰上静置 5 min，于12 000 r/min、4 ℃离心15 min；(4)从离心机中取出离心管，此时匀浆分为3层，上层为无色水相上清(RNA所在层)，中间层为白色蛋白层，下层为有机层，小心吸取上清液转移至新的离心管中并做好标记，勿吸取白色中间层；(5)向上清液中加入与上清液等体积的异丙醇，上下轻柔颠倒，于室温静置10 min；(6)于12 000 r/min、4 ℃离心10 min；(7)轻轻倒掉上清液，沿离心管壁缓慢加入1 mL 75%预冷乙醇(提取RNA专用)，轻轻上下颠倒洗涤沉淀，于12 000 r/min、4 ℃离心5 min，小心倒掉75%乙醇；(8)室温下干燥沉淀2～5 min，待乙醇完全挥发后，加入60 μL DEPC水溶解沉淀；(9)用核酸定量仪测定RNA浓度，于-80 ℃保存备用。

1.3.4 RNA反转为cDNA 参照PrimeScript(TaKaRa)反转录试剂盒说明书进行反转录反应，合成相应的cDNA。1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL样品RNA，补加Rnase Free dHO至10 μL，于42 ℃水浴2 min，即可得到消除基因组的DNA体系。在上述体系中，加入Reaction solution from Step 1 10 μL，5×Primerscript Buffer 2 4 μL，Primerscripr Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，Rnase Free ddHO 4 μL，涡旋混匀，置于PCR仪中进行反转录，反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.3.5 引物的设计 为了筛选天麻中的软化酶，本研究在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中查阅相关文献，以了解软化相关酶的种类，由于天麻软化相关酶基因在NCBI数据库上未见公布，因此选取与其同科植物的相关基因序列，用BLAST进行比对，选取高度保守的序列，结合引物设计的原则，用Primer 5.0软件，每个基因设计2～3对引物，共设计22对引物。

1.3.6 通过普通PCR法筛选引物 以cDNA为模板，按照PCR反应体系将所需试剂依次加入PCR管中，具体反应体系为0.6 μL模板DNA，7.5 μL Mix，0.7 μL上游引物，0.7 μL下游引物，5.5 μL灭菌水，总体积15 μL。反应程序为：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，循环34次；72 ℃ 延伸30 s，72 ℃充分延伸10 min，12 ℃保存。

1.3.7 Real-time qPCR检测软化相关酶编码基因的mRNA表达水平 Real-time qPCR的具体操作参照TaKaRa的说明书，每个基因做3个重复，20 μL 反应体系：10 μL SYBR，1.6 μL上游引物(10 μmol/L)，1.6 μL下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，4.8 μL ddHO。采用两步法PCR反应程序，具体反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，循环50次；95 ℃延伸 15 s，72 ℃充分延伸10 min，12 ℃保存。

1.4 数据统计

用Excel 97-2003进行数据整理并分析结果。

2 结果与分析

2.1 天麻保鲜过程中的表型分析

本试验每隔7 d取样1次，同时拍照记录样品的表型。经统计发现，天麻在保鲜过程中的表型变化具有以下特征：(1)天麻在自然条件下(空白对照组)逐渐变软，颜色由白色变成淡黄色；(2)经茶多酚涂膜的天麻颜色与空白组相比差异不显著，用刀不易切开；(3)经过超高压处理的天麻整体变脆，很容易用小刀切成块状，且有汁液流出；(4)用茶多酚涂膜并进行超高压处理的天麻水分较多，取样后袋中有较多汁状液体残余，相较于其他3种处理方式样品的颜色更深(图1)。

2.2 RNA质量的检测

为了检测RNA的质量，随机选取部分RNA样品，并用2%琼脂糖凝胶电泳检测。从图2可以看出，所有样品总RNA的28S、18S RNA主峰单一、清晰无降解，说明提取的RNA质量较好，可用于后续研究。

2.3 引物的筛选

由于在NCBI等数据库中未检索到天麻软化相关酶的编码基因序列，因此本试验选取多个与天麻同科或同种植物软化相关酶的编码基因序列，经BLAST软件比对，选取高度保守序列，结合引物设计原则，用Primer 5.0工具，每个基因设计2～3对引物，共设计22对引物，其中为内参基因引物，引物序列见表1。

表1 天麻软化表达酶相关基因引物

用PCR扩增后，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，由图3、图4可以看出，只有组织蛋白酶(Cathepsin)和过氧化物酶(POD)扩增出相应条带，其他引物均未检测到条带。

2.4 天麻软化相关酶的表达趋势

以空白样(处理0 d)为对照进行数据处理，并绘制成折线图。由图5可以看出，28 d前，PL、Cathepsin这2种酶的编码基因的mRNA水平变化趋势一致，都是先升后降；PME则前期出现一个快速下降的趋势；Papain的表达水平为先升高再降低；POD相对表达量在处理28 d前与Papain相对表达

量变化趋势相似，但在处理28 d后则迅速升高。

2.5 PL编码基因的相对表达量

本试验通过qPCR检测PL基因的mRNA相对表达量，结果发现，PL在所有天麻样品中都有表达，经过茶多酚涂膜的样品，其PL的相对表达量明显低于空白组；用超高压处理的天麻样品，在处理14 d时PL的表达量显著低于空白组，但是随着保鲜时间的增加，PL的相对表达量明显升高；用茶多酚涂膜+超高压处理的天麻样品，在处理14 d时的表达量极显著高于空白对照组，并且随着保鲜时间的增加，其表达量迅速降低(处理21 d左右)，之后有所上升，但表达水平的变化差异不明显(表2)。

表2 PL的mRNA相对表达量

2.6 PME编码基因的相对表达量

果胶甲酯酶可以降解植物细胞壁中的果胶，在植物中普遍表达。在处理时间为14 d时，茶多酚涂膜的天麻样品中PME的表达量低于空白对照组，而在处理时间超过35 d后则高于空白对照组；经茶多酚涂膜+超高压处理的样品在处理前21 d均低于空白对照组，在处理35 d时略有升高；超高压处理样品PME的相对表达量表现为先升高后降低的趋势(表3)。

表3 PME的mRNA相对表达量

2.7 POD编码基因的相对表达量

过氧化物酶具有抗氧化性，经qRCR检测发现，处理14 d时，3种不同处理方式的天麻样品中POD编码基因的相对表达量均低于空白对照组，但在处理21 d时，经超高压处理的天麻样品中POD编码基因的相对表达量极显著高于空白对照组，其他2种则与空白组差异不大；在处理28 d时，天麻样品中POD编码基因的相对表达量均高于空白组，且茶多酚涂膜的天麻样品中POD编码基因的相对表达量提高了20倍；在处理35 d时，茶多酚涂膜、超高压处理的天麻样品中POD编码基因的相对表达量显著低于空白对照组，而茶多酚涂膜+超高压处理的天麻样品中POD的相对表达量与空白组略接近(表4)。

表4 POD的mRNA相对表达量

2.8 Papain编码基因

为了分析Papain在天麻软化过程中的表达情况，用qPCR检测Papain编码基因的表达水平。由表5可以看出，茶多酚涂膜处理的天麻样品的Papain编码基因相对表达量在处理前28 d均低于空白组，但在处理35 d后则略高于空白组；在超高压处理下，天麻样品的Papain编码基因的相对表达量远远高于空白对照组，在处理35 d时提高到处理7 d时的437倍左右；在茶多酚涂膜+超高压处理下，天麻样品的Papain编码基因相对表达量在处理 14 d 时高于空白对照组，但在处理21 d时迅速降低，随后又缓慢提高，但都低于对照。

表5 Papain的mRNA相对表达量

2.9 Cathepsin编码基因的相对表达量

Cathepsin的主要功能是降解蛋白质，经qPCR检测发现，茶多酚涂膜处理的天麻样品Cathepsin编码基因的相对表达量始终低于空白对照组；在超高压处理下，天麻样品的Cathepsin编码基因的相对表达量先升高后降低，且远远高于空白对照组；在茶多酚涂膜+超高压处理下，天麻样品的Cathepsin编码基因的相对表达量在处理14 d时提高到处理7 d时的103倍，在处理21 d时提高至处理7 d时的8倍；在处理35 d时上升到处理7 d时的232倍(表6)。

表6 不同处理时间Cathepsin的mRNA相对表达量

3 讨论

近年来，关于天麻保鲜的研究主要集中在生理生化指标测定方面，随着科学技术的发展，相关研究正逐步向生物技术靠拢。大量研究发现，果蔬的软化与细胞壁有密切关系，植物细胞壁的主要成分为纤维素、果胶，而高等植物细胞壁中果胶含量较高，是植物细胞间质的重要成分，因此，与植物细胞壁有关的酶与天麻的软化程度密切相关。目前关于天麻软化相关酶的报道较少，本试验选取与天麻同科或同属植物软化相关酶的基因序列，用BLAST进行序列比对，选取高度保守的序列，用Primer 5.0工具，每个基因设计2～3对引物，共设计22对引物，经过普通PCR扩增筛选及qPCR筛选，最终选取PL、PME、Papain、POD和Cathepsin等5种软化酶进行分析，分别在3种不同包装方式的天麻样品中检测了上述软化酶的表达差异。在天麻软化过程中，这5个基因的mRNA表达水平均受到影响，果胶裂解酶在经茶多酚涂膜后表达量显著降低，说明这种处理方式抑制了PL的表达，保鲜效果较好；而在经过3种不同包装方式处理后，PME的表达水平变化以显著为主，说明PME的表达可能不受这3种包装方式的影响；经3种不同方式处理的天麻样品贮藏35 d时POD的相对表达量均低于空白组，说明POD减缓了天麻的氧化程度，具有较好的保鲜效果；经超高压处理后，Papain的相对表达量升高，说明经过这种方式促进了Papain的表达，天麻软化程度加深，但经过茶多酚涂膜+超高压处理后的天麻Papain的相对表达量比超高压处理的天麻的表达量低，进一步说明茶多酚涂膜的保鲜效果较好；茶多酚涂膜的天麻样品种组织蛋白酶的相对表达量始终低于空白组，而其他处理方式的Cathepsin相对表达量升高，说明茶多酚涂膜有利于天麻的保鲜。综上所述，茶多酚对天麻保鲜的效果较好，而超高压处理反而促进了天麻的软化，推测可能是超高压处理时的温度、压强和处理时间不佳造成的；在分子水平上，天麻软化过程是由多个基因共同调控的，而本试验仅选取且研究了一小部分基因，不能够完全展现天麻在保鲜过程中的软化调控机制，天麻的软化相关基因的调控机制还需进一步探索，本试验的结果可为进一步的研究奠定基础，为天麻保鲜研究提供参考。