王思文， 杜艳丽， 刘 权， 殷奎德

(1.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆 163319； 2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319)

大豆是我国重要的油料作物，其生长过程受到干旱胁迫影响，严重时可导致产量和品质下降。目前，提高大豆抗旱性主要是通过选育抗旱品种和改进栽培等方法，而利用蛋白激发子提高植物抗旱性是目前研究的热点。

蛋白激发子作为一种环境友好的外源性刺激因子，可以调控基因的表达，进而诱导体内一系列代谢循环，促进植物生长发育，提高植物对非生物胁迫的抗性。目前，有报道称蛋白激发子可以提高植物的抗旱性。蛋白激发子AMEP是从枯草芽孢杆菌中分离纯化的一种新型蛋白激发子，它可以刺激植物产生过敏反应，引起活性氧的积累，提高抗逆相关蛋白酶的活性等防卫反应。这些防卫反应会进一步激活植物的免疫系统，从而缓解外界胁迫带来的伤害。然而，蛋白激发子AMEP是否能够提高植物的抗旱性，还有待进一步验证。

近年来，植物高通量表型分析技术逐渐成熟，该技术可利用自动化、远程操控及图像数据分析而应用于各类植物表型的研究中，具有数据精准度高且对植株无损伤的特性。随着高通量植物表型分析技术的不断发展和完善，形成了大体量数据、多种学科技术相融合、数据多样的植物表型组学体系，该体系覆盖了植物从细胞到群体的不同方向、不同生长环境下其性状的遗传与变异，以及植物对非生物胁迫的响应等。

本研究利用多光谱植物激光三维扫描仪、叶绿素测定仪、叶绿素荧光仪、光合仪对大豆形态参数、生理参数进行实时测定，以期利用快捷、方便的高通量表型数据分析技术解析蛋白激发子AMEP对大豆幼苗抗旱性的提升作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试验设计

以大豆品种绥农26为试验品种，于2021年5月5日进行盆栽试验。在打孔塑料盆(上口径 9.0 cm，下口径5.5 cm，高17.5 cm)中装入0.4 kg土后用水浇透，于第 2 天清晨每盆播 4 粒已经消毒且色泽均匀、大小一致的大豆种子，种子上均匀覆盖0.1 kg土壤，大豆生长至V1期时每盆保留1 株生长均匀一致的幼苗。

于大豆第3节期(V1)期土壤相对含水量达到80%时，停止浇水并喷施AMEP蛋白(浓度为 0.5 mg/mL)，对照喷施蒸馏水后连续干旱，根据土壤含水量的百分比可分为3个干旱程度：轻度干旱组LD(土壤相对含水量为>60%～70%)，中度干旱组MD(土壤相对含水量为>50%～60%)，重度干旱组SD(土壤相对含水量为35%～50%)。对照组CK相对含水量保持在80%左右。本试验设1个对照和2个处理，即对照CK(喷施蒸馏水+非干旱处理)，DS处理(喷施蒸馏水+干旱处理)，ADS处理(喷施蛋白激发子AMEP+干旱处理)。在停止浇水时喷洒蒸馏水或蛋白激发子AMEP。重复3 次。

1.2 测量项目与方法

1.2.1 土壤含水量测定

引用周明欣的干燥法测定土壤的水分含量。从大豆幼苗盆中取出土壤，置于 105 ℃ 的烘箱中进行烘干处理，干燥后损失的水分就是土壤的含水量。烘干前土壤质量为，烘干前土壤质量减去烘干后土壤质量即为土壤水分质量，土壤的含水量计算公式为：土壤含水量=×100。

1.2.2 表型测定 使用多光谱植物激光三维扫描仪Plant Eye F500对植株进行表型测定，测定时为了减少多株叶片重叠覆盖对测量数据的影响，测量前保持每盆1株植株。将植株放在扫描范围内对大豆幼苗的株高、数字生物量以及3D叶面积、叶片倾斜度、Hue(色相)、归一化植被指数(NDVI)等进行扫描测量。

叶片倾斜度=3D叶面积/投影叶面积；

数字生物量=3D叶面积×株高。

1.2.3 SPAD值测定 SPAD值可以用来表示叶绿素的相对含量。在大豆幼苗长到V1期时使用Minolta SPAD502便携式叶绿素仪，选择大豆幼苗的第一复叶中3张小叶的不同部位进行SPAD值的测量。

1.2.4 光合测定 使用LI-6400光合仪(Li-Cor，Hunting)，在晴天上午10：00时，测定了无病虫害和机械损伤的大豆第一复叶的光合参数。待实测参数稳定后，测定叶片胞间CO浓度(intercellular COconcentration，)、叶片的蒸腾速率(transpiration rate，)、叶片净光合速率(net photosynthetic rate，)、气孔导度(stomatal conductance，)的数值，其中测定的叶室温度 20 ℃，光照度为1 000 μmol/(m·s)。

1.2.5 叶绿素荧光测定 使用便携式叶绿素荧光仪(FMS-2，Hansatech，England)测量大豆幼苗叶片的叶绿素荧光，在测量暗反应前先选择大豆的第1张复叶进行避光处理30 min，然后在 2 000 μmol/(m·s) 的饱和光强条件下测量出最大荧光 () 、最大光化学效率 (/)、初始荧光()。在光适应下打开远红光，可测量出光化学淬灭系数() 、非光化学淬灭系数()、PSⅡ实际光量子产量[Y(Ⅱ)]、PSⅡ调节性能量耗散的量子产量[Y(NPQ)]、光合电子转移速率(ETR)的值。

1.3 统计分析

最后得到的数据采用Excel 2010进行分析，利用制图软件Origin 9.0进行制图，SPSS 20.0软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白激发子AMEP对干旱胁迫下大豆幼苗形态及参数的影响

干旱胁迫会导致大豆幼苗植株叶片萎蔫下垂，水分失去平衡，茎生长缓慢，大豆幼苗的株高降低，茎比正常小。图1为3种干旱程度下大豆幼苗形态对比，可以看出随着干旱胁迫的加重，大豆幼苗叶面受损也随之加重。在轻度干旱胁迫下，蛋白激发子AMEP处理后的大豆幼苗与对照叶片损伤差异不明显；在中度、重度干旱下，由于水分逐渐缺失，DS处理较ADS处理受胁迫也逐渐加重，且在重度干旱胁迫下效果最为明显。在重度干旱胁迫下DS处理的叶片萎蔫程度较ADS处理更明显，叶绿素含量也较ADS处理更少，说明蛋白激发子AMEP可以有效提高大豆幼苗的抗旱性。

由表1可知，干旱会降低大豆幼苗数字生物量，喷施蛋白激发子AMEP后可显著提高数字生物量，在重度干旱下差异最大，ADS处理较DS处理增加37.99%；干旱会影响株高，喷施蛋白激发子AMEP后株高提升显著，在轻度、中度、重度干旱下分别较DS处理高20.35%、23.41%、9.47%；喷施蛋白激发子AMEP后可提高大豆幼苗色调值Hue；显著增加了3D叶面积，在轻度、中度、重度干旱下分别较DS处理增加27.57%、19.10%、40.78%；在轻度、中度干旱条件下，喷施蛋白激发子AMEP后投影面积略有增加，在重度干旱胁迫下投影面积没有变化；3种胁迫程度下，喷施蛋白激发子AMEP后光穿透深度值较DS处理分别增加45.97%、43.64%、37.58%，光穿透深度值的增加说明蛋白激发子AMEP处理下的大豆叶片层叠程度更小。归一化植被指数(NDVI)能够体现出植物的生长状况。张佳华等认为，NDVI也可以体现植株的光合作用强弱。蛋白激发子AMEP能够提高干旱胁迫下的归一化植被指数，并在轻度、中度、重度干旱下分别较DS处理增加1.15%、19.64%、19.67%。干旱胁迫影响了大豆幼苗的生长，随着干旱程度加重其影响越大，施用蛋白激发子AMEP可以缓解干旱对大豆幼苗不利生长的影响。

表1 不同程度干旱胁迫下大豆幼苗形态特征

2.2 蛋白激发子AMEP对干旱胁迫下大豆幼苗叶片光合特性的影响

图2至图5显示，在干早胁迫下大豆幼苗叶片中胞间CO浓度()、净光合速率()、气孔导度()、蒸腾速率()的参数均有所降低。随着土壤含水量的减少，大豆幼苗水分缺失不断加剧，蛋白激发子AMEP处理后，在轻度、中度、重度干旱下，与DS处理相比，ADS处理的分别增加了11.73%、

23.07%、44.44%，分别增加24.00%、18.18%、35.29%，分别增加17.64%、25.00%、50.00%，分别增加14.81%、22.72%、38.89%。干旱胁迫下，由于大豆叶片气孔的关闭，降低和的值，从而影响光能捕捉能力，导致净光合速率降低。施用蛋白激发子AMEP可以不同程度地提高叶片的光合参数，说明干旱条件下喷施蛋白激发子AMEP可以提高大豆光合作用效率。

2.3 蛋白激发子AMEP对干旱胁迫下大豆幼苗叶片叶绿素荧光特性的影响

从图6可以看出， 蛋白激发子AMEP显著提高了大豆叶片的SPAD值(<0.05)，在轻度、中度、重度干旱条件下，ADS处理分别比DS处理提高了4.87%、18.75%、28.00%。由图7至图10可知，在干旱胁迫下测定的大豆幼苗叶片的PSⅡ实际光化学效率 ()、潜在光化学效率(/)、光能转化效率(/)、表观电子转移速率(ETR)均较CK有所下降，随着干旱程度的加重，各项指标下降明显，在重度干旱胁迫下差异最显著，分别下降7.14%、9.37%、7.69%、6.06%。轻度干旱胁迫下大豆幼苗的/、、/、ETR与CK无显著差异，说明轻度干旱胁迫对大豆幼苗的叶绿素荧光参数影响不大。干旱胁迫下，蛋白激发子AMEP能显著提高大豆幼苗叶片的/、/、ETR、，在中度干旱和重度干旱条件下与CK相比分别提高35.00%、20.37%、25.00%、18.18%和46.66%、25.00%、33.33%、20.00%。蛋白激发子AMEP能在一定程度上缓解干旱胁迫对大豆幼苗/、/、ETR、的影响。

3 讨论

蛋白激发子可以激活植物产生防卫反应，进而激活植物免疫系统，调节植物生长和代谢，提高植物抗逆性，促进植物生长。前期研究中发现，蛋白激发子AMEP能够有效引起烟草叶片的过敏反应，增加抗氧化酶防御、相关蛋白酶的表达和提高植物抗逆性等早期防卫反应，如抗旱性。本研究表明，在干旱胁迫下蛋白激发子AMEP可以改善大豆幼苗表型受损程度，提高大豆的光合速率、叶绿素含量、叶绿素荧光特性，进而缓解干旱对大豆幼苗生长的抑制，减轻干旱胁迫的损害。

干旱胁迫是影响大豆生长的主要胁迫因素。干旱胁迫会导致大豆的内部结构发生异常生理反应，如叶片萎蔫、枯黄，植株矮化，甚至会导致死亡。干旱胁迫通过诱导部分叶片脱落来改变冠层的形态结构，导致叶片面积更小、更厚，从而减少水分的消耗和损失，同时增强持水能力，提高植物对缺水环境的适应性。本研究结果表明，干旱胁迫下喷施蛋白激发子AMEP可以提高大豆幼苗的株高、投影叶面积、3D叶面积、光穿透深度、叶片倾角等形态参数。这说明蛋白激发子AMEP能缓解干旱胁迫对大豆幼苗生长的影响，具有提升大豆抗旱性的作用。

光合作用是植物最重要的生理过程之一，其中光合参数作为植物生长和抗逆性的重要指标，能反映植物对环境的适应性。一般来说，影响植物光合作用的因素可分为气孔因子和非气孔因子。农开云等发现，净光合速率下降的主要因素在轻度干旱胁迫下是由于气孔限制引起的，而重度干旱胁迫下，则是由于非气孔限制。本研究结果表明，喷施AMEP蛋白缓解了干旱胁迫引起的气孔导度下降，从而提高了、、光合速率。光合速率的增加可以促进光合产物的运输和积累，减轻细胞在干旱胁迫下的氧化损伤。SPAD值反映了植物的相对叶绿素含量，在一定条件下，SPAD值可以用来代替叶绿素含量评估植物健康状况。喷施蛋白激发子AMEP可有效提高大豆幼苗叶片的相对叶绿素含量和光合效率，从而减少干旱胁迫的危害。叶绿素荧光特性可以反映叶片光合系统对光能的吸收、传输和分布，通过研究叶绿素的荧光特性，我们可以了解植物在胁迫下的生理状态。干旱胁迫抑制光合速率，导致光能的过度吸收，从而导致活性氧的积累和光合系统的损害。光合系统受损导致碳同化能力减弱，形成恶性循环，/、/、PSⅡ、ETR降低。随着干旱胁迫的加重，光系统的损伤加重，蛋白激发子AMEP可以提高光合效率、电子传递速率、光能转化效率。

传统的植物表型测量主要依靠人工，不仅劳动量大、效率低，而且测量质量受人为因素影响较大，几乎不可能对大量样本的生长发育进行测量。近年来，包括光学成像技术在内的高通量表型分析技术以其快速、高效、无损伤、高灵敏度的优点，为获取植物叶片/冠层形态生长模型、胁迫响应、光合作用等信息提供了极大帮助。本研究利用高通量植物表型分析技术，对不同程度干旱胁迫下蛋白激发子AMEP对大豆幼苗的影响进行表型测定分析，为蛋白激发子AMEP提高大豆幼苗植株抗旱性提供高效快速的表型数据。

4 结论

通过高通量表型分析技术研究了蛋白激发子AMEP对干旱胁迫下大豆幼苗生长的影响，包括大豆幼苗表型、光合参数、荧光参数等。形态表型检测表明蛋白激发子AMEP可显著缓解干旱对大豆幼苗生长的抑制，减轻干旱胁迫的损害。光合参数和荧光参数指标检测结果表明，蛋白激发子AMEP可以通过调节气孔导度、细胞间CO浓度、蒸腾速率来提高大豆的净光合速率，进而提升叶绿素含量、光能转换潜力、电子传递效率、PSⅡ光化学效率，提高光合效率。由此可见，通过高通量表型分析技术，可实现对蛋白激发子AMEP提高大豆抗旱性进行快速准确的鉴定。