谢舟煜何艾舟李婷魏娟王爱红吴云川张洪兵*

(1.南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院,南京 210023;2.南京中医药大学护理学院,南京 210023)

肥胖是一种以体内脂肪过度积累和储存,伴有体重增长的状态[1]。据报道,全球肥胖与超重人数均呈上升趋势,肥胖已成为一个公共健康问题,防治肥胖刻不容缓[1-2]。肥胖既是一种多因素的代谢疾病,同样也是心血管等疾病的高危因素[1,3]。肥胖患者通常出现血脂代谢紊乱,而脂质代谢障碍可不同程度的损害内皮细胞数量和功能[3]。内皮功能障碍作为肥胖发展过程中的一项病理产物,是动脉粥样硬化的早期病理基础[3-4]。改善内皮功能障碍是心血管疾病预防和康复的关键环节。

近年来,随着代谢疾病和心血管疾病发病率的不断上升,脂肪因子在人体的作用受到越来越多的关注。其中,内脂素作为脂肪组织的一种分泌物质,参与到动脉粥样硬化的进程中,诱导血管再生,加速斑块的形成[5]。此外,心外膜脂肪组织被认为是一个独特的脂肪储存库,通过内分泌和旁分泌功能,对心脏和冠状动脉产生深远的影响[6]。

运动疗法在疾病预防康复过程中,受到越来越多的关注,但在代谢疾病的康复治疗与心血管疾病的临床预防中尚未广泛普及。本研究拟通过高脂饮食诱导大鼠形成肥胖模型,进行中等强度有氧运动干预,研究运动对肥胖大鼠内皮功能障碍及心外膜脂肪组织中内脂素的影响,为运动疗法在心血管病早期预防的推广以及后期相关机制的深入研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30只7周龄SPF级健康雄性SD大鼠,体重约(200 ± 20)g,购自南京市青龙山动物繁殖场【SCXK(苏)2017-0001】。自由饮食、饮水,常规适应性饲养1周后用于实验。饲养环境:12 h明暗交替环境,温度控制在20 ~ 22℃,相对湿度保持在45% ~ 50%,大鼠全部饲养于南京中医药大学实验动物中心屏障环境中【SCXK(苏)2018-0049】。所有实验程序均通过南京中医药大学动物实验中心伦理委员会批准(审批号:202011A012)。

1.1.2 主要试剂与仪器

甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高 密 度 脂 蛋 白(high-density lipoprotein,HDL)、低 密 度 脂 蛋 白(low-density lipoprotein,LDL)测定试剂盒,均购自深圳雷杜生命科学股份有限公司;大鼠血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)和内脂素ELISA试剂盒,均购自上海茁彩生物科技有限公司。MICROCL21R型离心机(Thermo,美国),Chemray800型全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技),Epoch型酶标检测仪(BioTeK,美 国),CFX型 荧 光 定 量PCR仪(Appliedbiosystems,美国),YD-6L2型生物组织冷冻包埋机(金华市益迪医疗设备有限公司),RM2235型切片机(Leica,德国),DM-1000型显微镜(Leica,德国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模

适应性饲养1周后,先随机将30只大鼠分为2组:空白组8只,造模组22只。空白组继续普通饲料喂养;造模组改用高脂饲料喂养[7](高脂饲料:45%脂肪,35%碳水化合物,20%蛋白质),喂养8周后称重。造模成功标准[8]:高脂饲料喂养的大鼠体重超出空白组大鼠平均体重的20%。最终,造模组成模16只。将成模大鼠分为2组:模型组和有氧运动组,每组各8只。

1.2.2 干预措施

空白组:全程普通饲料喂养,不进行有氧运动干预,饲养8周;模型组:全程高脂饲料喂养,不进行有氧运动干预,饲养8周;有氧运动组:全程高脂饲料喂养,并进行有氧运动干预。有氧运动:参考Bedford的动物运动负荷标准[9],选取中强度有氧运动,采用无负重动物实验跑台进行训练,跑台坡度为0°。有氧运动初始速度为15 m/min,时间15 min,往后每天速度增加1 m/min,时间增加5 min,直到速度为20 m/min,时间为60 min,每周干预6 d,休息1 d,干预8周。

1.2.3 一般情况

每周日观察并记录各组大鼠的体重、体长(为鼻尖到肛门的距离),并计算Lee’s指数[10]。取材后,称取肝、肾、肾周脂肪和附睾周围脂肪的重量,并计算脂体比[10-11]。

1.2.4 血脂检测

在末次运动干预结束24 h后,各组禁食12 h后取材。用20%乌拉坦按7 mL/kg量对大鼠进行腹腔麻醉,腹主动脉取血,静置4 h后,以3500 r/min离心15 min,分离血清并分装,存于-80℃冰箱保存。采用全自动生化仪自动测定TG、TC、HDL及LDL含量。

1.2.5 血清检测

按照ELISA试剂盒说明加样、加酶、温育、配液、洗涤、显色、终止,用酶标仪依序测定各样本吸光度,以标准品的浓度为纵坐标,OD值为横坐标,绘出标准曲线,查出各样本相应的TM和内脂素含量。

1.2.6 实时荧光定量PCR法检测心外膜脂肪组织中内脂素mRNA的表达量

取材取血后,分离心外膜脂肪组织,迅速放入液氮罐中。样本采集结束后,从液氮罐中取出组织分装并转移到-80℃冰箱保存。采用RNA提取液提取心外膜脂肪组织中的总RNA,并将RNA反转录为cDNA,根据设计的引物进行PCR合成(见表1)。PCR反应条件为:95℃ 10 min预变性,95℃ 15 s变性,60℃ 30 s火焰,72℃ 1 min延伸,40个循环。每组平行设3个复孔,以GAPDH作为内参照。按照各目的基因的CT值,用2-ΔΔCt法比较mRNA的表达。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 主动脉苏木精-伊红(HE)染色

取材取血后,剥离每只大鼠主动脉,存放于4%多聚甲醛溶液中固定1 d。选取主动脉弓部组织3 mm进行洗涤、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、中性树脂封片,显微镜下观察主动脉形态结构的病理变化。

1.3 统计学分析

使用SPSS 26.0软件进行统计分析。数据采用平均值 ± 标准差(±s)表示,组间数据比较采用单因素方差分析,两两间比较采用t检验。P＜ 0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 体重、体长和Lee’s指数的变化

表2显示,与正常组比,模型组和有氧运动组大鼠体重、体长干预前后均明显升高(P＜ 0.01),Lee’s指数干预前上升显著(P＜ 0.05),干预后均有下降趋势,但有氧运动组差异更具有显著性(P＜ 0.05);与模型组比,有氧运动组大鼠体重、体长、Lee’s指数干预前均无差异(P＞ 0.05),干预后体重和Lee’s指数均下降明显(P＜ 0.01)。与干预前比,正常组和模型组干预后大鼠的体重、体长和Lee’s指数均明显升高(P＜ 0.01),有氧运动组干预后大鼠的体重变化无统计学意义(P＞ 0.05)、体长明显变长(P＜ 0.01)、Lee’s指数明显降低(P＜ 0.01)。

表2 各组大鼠干预前后体重、体长和Lee’s指数的变化(±s,n = 8)Table 2 Changes in body weight, length and Lee’s index of rats in each group before and after intervention(±s,n = 8)

表2 各组大鼠干预前后体重、体长和Lee’s指数的变化(±s,n = 8)Table 2 Changes in body weight, length and Lee’s index of rats in each group before and after intervention(±s,n = 8)

注:与正常组相比,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01;与模型组相比,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01;与干预前相比,& P ＜ 0.01。(下表同)Note.Compared with the normal group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01.Compared with the model group, #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01.Compared with before the intervention, &P ＜ 0.01.(The same in the following tables)

组别Groups体重(g)Weight(g)体长(cm)Length(cm)Lee’s指数Lee’s index干预前Before干预后After干预前Before干预后After干预前Before干预后After正常组Normal 429.7 ± 21.8 515.5 ± 31.5& 20.1 ± 0.6 25.8 ± 0.8& 375.1 ± 11.2 311.6 ± 11.8&模型组Model 570.0 ± 26.8**682.0 ± 22.3**& 21.2 ± 0.4** 28.6 ± 0.6**& 390.8 ± 12.5* 308.1 ± 7.9&有氧运动组Exercise 562.2 ± 20.8**559.2 ± 19.6**## 21.2 ± 0.5** 28.0 ± 0.4**& 389.9 ± 10.8* 294.5 ± 4.4*##&F 91.931 95.324 11.071 45.663 4.669 8.840 P＜ 0.001 ＜ 0.001 0.001 ＜ 0.001 0.021 0.002

2.2 内脏重量、内脏脂肪重量和脂体比的比较

表3显示,与正常组相比,模型组和有氧运动组肝重量、肾重量、肾周脂肪重量和脂体比均明显升高(P＜ 0.01),模型组附睾周围脂肪重量明显上升(P＜ 0.01),有氧运动组附睾周围脂肪重量升高显著(P＜ 0.05);与模型组相比,有氧运动组肝重量、肾周脂肪重量均明显降低(P＜ 0.01)。

表3 各组大鼠内脏重量、内脏脂肪重量和脂体比的比较(±s,n = 8)Table 3 Comparison of visceral weight, visceral fat weight and fat body ratio of rats in each group(±s,n = 8)

表3 各组大鼠内脏重量、内脏脂肪重量和脂体比的比较(±s,n = 8)Table 3 Comparison of visceral weight, visceral fat weight and fat body ratio of rats in each group(±s,n = 8)

组别Groups肝重量(g)Liver weight(g)肾重量(g)Kidney weight(g)附睾周围脂肪重量(g)Epididymal fat weight(g)肾周脂肪重量(g)Perirenal fat weight(g)脂体比(g)Fat body ratio(%)正常组Normal 10.44 ± 1.46 2.61 ± 0.37 3.80 ± 0.59 4.49 ± 2.04 1.62 ± 0.50模型组Model 28.18 ± 4.31** 3.28 ± 0.21** 7.76 ± 2.38** 13.51 ± 2.63** 3.12 ± 0.67**有氧运动组Exercise 22.88 ± 2.68**## 3.17 ± 0.44** 6.39 ± 1.86* 9.84 ± 2.93**## 2.91 ± 0.83**F 71.350 8.330 10.238 25.083 11.344 P＜ 0.001 0.002 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

2.3 血脂、TM和内脂素的比较

表4显示,与正常组相比,模型组的TG、TC、LDL、TM和内脂素水平均明显升高(P＜ 0.01),有氧运动组的LDL和TM水平均明显升高(P＜ 0.01),模型和有氧运动组的HDL均明显下降(P＜ 0.01);与模型组相比,有氧运动组TG、TC、LDL、TM和内脂素水平均明显下降(P＜ 0.01),HDL水平明显上升(P＜ 0.01)。

表4 各组大鼠血脂、TM和内脂素的比较(±s,n = 8)Table 4 Comparison of blood lipids, TM and visfatin of rats in each group(±s,n = 8)

表4 各组大鼠血脂、TM和内脂素的比较(±s,n = 8)Table 4 Comparison of blood lipids, TM and visfatin of rats in each group(±s,n = 8)

组别Groups TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL(mmol/L) LDL(mmol/L) TM(ng/mL) 内脂(ng/mL)Visfatin(ng/mL)正常组Normal 0.531 ± 0.076 1.431 ± 0.158 1.212 ± 0.236 0.133 ± 0.066 5.848 ± 1.165 20.795 ± 3.198模型组Model 0.835 ± 0.159** 2.019 ± 0.218** 0.389 ± 0.067** 0.578 ± 0.133**15.825 ± 1.390** 42.129 ± 6.110**有氧运动组Exercise 0.592 ± 0.192## 1.470 ± 0.213## 0.671 ± 0.115**## 0.331 ± 0.072**## 8.558 ± 1.655**## 23.458 ± 2.947##F 9.171 22.084 57.092 43.507 105.960 57.663 P 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

2.4 心外膜脂肪组织中内脂素mRNA表达量的比较

图1显示,与正常组相比,模型和有氧运动组心外膜脂肪组织中内脂素mRNA的表达量均明显升高(P＜ 0.01),模型组增高到6.5倍,有氧运动组增高到3.2倍;与模型组相比,有氧运动组心外膜脂肪组织中内脂素mRNA表达量显著下降(P＜ 0.05)。

2.5 主动脉HE染色的比较

图2显示,正常组主动脉形态完整、结构清晰,细胞排列紧致,内皮细胞扁平光滑完整,中膜平滑肌细胞厚薄均匀;模型组细胞排列紊乱,内皮细胞出现损伤和坏死脱落,中膜增生变厚,管壁松弛,平滑肌细胞体积增大,并出现大量泡沫细胞;有氧运动组细胞排列相对整齐,内皮细胞较完整,中膜平滑肌细胞轻度增生,伴有少许泡沫细胞。

图2 大鼠主动脉形态结构(HE染色,×400)Figure 2 Morphology and structure of rat aorta(HE staining, ×400)

注:与正常组相比,**P ＜ 0.01;与模型组相比,#P ＜ 0.05。图1 各组大鼠心外膜脂肪组织中内脂素mRNA相对表达量的比较Note.Compared with the normal group, **P ＜ 0.01.Compared with the model group, #P ＜ 0.05.Figure 1 Comparison of the expression of Visfatin mRNA in the epicardial adipose tissue of rats in each group

3 讨论

肥胖作为一种代谢性疾病,也是心血管疾病的高危因素,往往会引起糖脂代谢功能的紊乱,对血管内皮功能造成一定的损伤[3,7-8,12]。有氧运动能够改善肥胖,对代谢相关疾病起着治疗作用[8]。而运动能否改善肥胖造成的内皮功能障碍,延缓动脉粥样硬化的进程,对心血管疾病的预防和康复有着重要意义。本研究通过高脂饮食诱导肥胖大鼠模型的建立,并进行8周的有氧运动干预,来观察运动对肥胖造成的体重增大、脂代谢紊乱、血管内皮功能障碍,以及心外膜脂肪组织中内脂素mRNA的表达和主动脉形态变化的影响,旨在探究运动对肥胖导致的动脉粥样硬化早期病理基础内皮功能障碍的治疗效果,为心血管疾病的预防和康复提供理论依据。

肥胖形成的脂质堆积,严重损害了血管内皮功能[3]。研究发现,肥胖会出现TC、TG、LDL的升高和HDL的降低,而血管内皮舒张功能与此密切相关[3,7]。TM作为一种血管内重要的凝血抑制因子,大量存在于血管内皮细胞表面,当内皮细胞损伤时,表面的TM出现脱落[13]。因此,TM被认为是诊断内皮功能障碍的一个重要指标[13]。本研究发现,模型组肥胖大鼠的体重、Lee’s指数、内脏重量、内脏脂肪含量、脂体比和TM水平均明显高于正常组,这印证了肥胖诱导的脂代谢紊乱会对内皮功能造成损伤,治疗肥胖、改善内皮功能是心血管疾病早期预防的关键。

心外膜脂肪组织是一个复杂的内分泌器官,它能通过内分泌、旁分泌和血管分泌等渠道,产生各类细胞因子和脂肪因子,调节血管功能[6]。其中,内脂素是一种有促炎反应特性的脂肪因子,能加速斑块的形成,与内皮功能障碍的发生关系密切,可作为预测冠状动脉粥样硬化严重程度的重要参考指标[5,14-15]。Romacho等[16]研究发现,内脂素通过Nampt依赖性TLR4介导的途径,上调NLRP3炎症小体的表达,诱导IL-1β的释放,导致小鼠内皮功能障碍。另有研究发现,内脂素通过NF-κB途径促炎性介质诱导内皮祖细胞凋亡,加速了内皮功能的损伤,而通过内脂素拮抗剂的使用,可阻断NF-κB信号通路,抑制内脂素诱导的炎症因子表达的上调,从而改善内皮功能障碍[17-18]。体外细胞实验发现,内脂素能激活内皮细胞ERK1/2通路,产生活性氧并诱导内皮素1(ET-1)的分泌,而ET-1的活性增强,会加速内皮功能障碍的发展[19]。本研究显示,高脂饮食诱导的肥胖大鼠血清中内脂素水平的显著提高,心外膜脂肪组织中内脂素mRNA表达含量的显著升高,以及主动脉形态结构的损伤,都提示肥胖造成的脂质代谢异常,脂肪的堆积,会诱导心外膜脂肪组织中促炎脂肪因子内脂素的释放,进而影响主动脉功能,造成内皮功能障碍的发生。这表明肥胖造成的心外膜脂肪中脂肪因子内脂素的异常分泌,可能与内皮功能障碍的发生以及动脉粥样硬化的形成关系密切。而炎症反应可能是其中重要的一环,也是我们后期研究的重点。

有研究发现,运动可以显著提高内皮祖细胞的数量,促进血管损伤后的修复,保护内皮功能,抑制动脉粥样硬化的发展[20-21]。Kadoglou等[15]发现,6个月的有氧运动降低了2型糖尿病患者血清内脂素的水平,同时改善了颈动脉内中膜的厚度,且二者间呈现相关性。另有研究发现,在急性运动干预后的3、4.5和6 h内,脂肪组织中内脂素的mRNA表达上调,而血浆内脂素水平和骨骼肌中内脂素的mRNA表达不受影响,这表明内脂素在运动后的恢复期具有局部代谢作用[22]。而Christensen等[23]也证实,有氧运动可以减少心外膜脂肪组织量,这对心血管疾病的预防十分重要。本研究显示,与模型组肥胖大鼠比,有氧运动组大鼠的体重、Lee’s指数、内脏脂肪重量和脂体比均显著降低,血清TG、TC、LDL、TM和内脂素水平均显著下降,HDL水平显著上升,心外膜脂肪组织中内脂素mRNA的表达显著下调,主动脉的病理损伤减轻,这提示有氧运动可以改善肥胖大鼠的内皮功能障碍,其机制可能是通过减少脂肪含量,改善脂代谢功能,下调心外膜脂肪组织中内脂素的基因表达,进而抑制内脂素的分泌,达到延缓内皮功能障碍进程的效果。

4 结论

本研究通过观察高脂饮食诱导肥胖大鼠的脂肪堆积、脂代谢功能及主动脉形态结构的变化,发现肥胖诱导的内皮功能障碍可能与脂肪因子内脂素的分泌异常关系密切。而有氧运动能够延缓肥胖大鼠内皮功能障碍的进程,减轻主动脉的病理损伤,抑制动脉粥样硬化的形成与发展,这可能与运动消耗了堆积的脂肪,改善了脂代谢功能的紊乱,下调了心外膜脂肪组织中内脂素的表达,抑制了内脂素的分泌有关。这对心血管疾病的早期预防具有重大指导意义,也为康复运动干预心血管疾病机制的深入研究奠定了一定的理论基础。