宋晨晨康台生张萌高凯史旭东郭建国

(中国医学科学院医学实验研究动物所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

太空环境复杂,包括微重力、辐射、昼夜节律的变化和极端温度,导致许多生物过程的变化[1-8]。微重力是航天员在太空中必须面对的关键问题之一。大量研究表明,长期失重会导致各种生理和病理变化,包括免疫系统、神经系统、生殖系统、心血管系统和骨骼肌组织的变化[9-14]。针对上述生理和病理变化,许多研究者制定了相关干预措施[15-20],例如在失重状态下安排训练,增加肌肉和骨骼强度,增加膳食蛋白质摄入和添加氨基酸、矿物质,探索失重前后膳食能量摄入的不同对下肢最大功率的影响。

既往研究发现,长期的空间飞行会导致航天员骨丢失骨折、肌肉萎缩和代谢紊乱[21-23]。骨小梁数量和骨小梁间距是失重条件下研究最多的骨参数[22,24-27]。Coulombe等[22]分析了长时间的人类太空飞行导致骨结构质量降低(如骨小梁微结构),并且通过受损的组织矿化、成熟和维持(由骨细胞介导)降低骨材料的质量。骨结构和骨材料都受到了微重力的影响,危及了航天员的骨骼健康,导致在返回地面时增加骨折的风险[22]。

在太空中进行微重力实验的成本高、效率低,以及在地面上产生微重力环境的时间太短,无法满足大多数生物实验的要求,对于微重力的研究主要依赖于动物模型[28-29]。3D回旋仪被广泛的应用于植物、细胞和线虫模拟微重力效应的研究中,被认为是模拟微重力效应最佳的办法之一。但是3D回旋仪模拟微重力效应对C57BL/J小鼠骨骼和代谢组学的影响尚未可知。因此,本研究旨在建立3D回旋仪模拟微重力效应的C57BL/J小鼠模型,探究3D回旋仪对C57BL/J小鼠骨骼和代谢的作用,为将来研究微重力效应提供一种小鼠模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30只8周龄健康雄性SPF级C57BL/J小鼠,体重15~25 g,购于北京维通利华公司【SCXK(京)2016-0006】。小鼠被置于12 h光照和12 h黑暗下,自由给予食物和水。随机分为3组:单独通风笼组(MC组,n= 6);生存盒组(SB组,n= 12);3D回旋仪组(CS组,n= 12)。所有小鼠适应饲养环境1周,饲养在中国医学科学院医学实验动物研究所动物屏障环境【SYXK(京)2019-0014】。本实验研究方法和实验动物均经中国医学科学院医学实验动物研究所伦理委员会批准(审批号:GJG21001)。

1.1.2 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠,生理盐水,乙腈( Merck,色谱纯,1499230-935),乙酸铵(Fluka,色谱纯,17836-50G),氨水(Sigma,色谱纯,16748-250 mL),Methanol(Fisher Chemical,色谱纯,A452-4),HPLC流动相A:水+25 mmol/L乙酸铵+25 mmol/L氨水,HPLC流动相B:乙腈。

3D回旋仪购买于中国科学院国家空间科学中心,生存盒(专利号:ZL202022855659.9),Micro-CT扫描仪(Inveon,Siemens, Berlin,德国),Triple TOF 6600+质谱仪(AB SCIEX),Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(Agilent),低温高速离心机(Eppendorf 5430R),色 谱 柱:Waters,ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm,2.1 mm × 100 mm column,超声破碎仪(宁波新芝JY92-II),真空离心浓缩仪(Eppendorf Concentrator Plus),Votex振荡器(上海琪特QT-1),MP Fastprep-24匀浆仪(MP Biomedicals),SIMCA-P 16.1(Umetrics,Umea,Sweden)。

1.2 方法

1.2.1 模拟微重力与样本采集

(1)3D回旋仪参数:旋转框架:2个,可独立旋转。载物台:面积400 mm × 300 mm,承重0 ~ 3 kg。光照板:面积400 mm × 300 mm。旋转模式:恒速旋转:± 0 ~ 10 rpm,转速分辨率0.1 rpm,10 ~ 30 rpm,分辨率1 rpm;随机旋转:转速:± 0 ~ 10 rpm,转速分辨率:0.1 rpm。可长期连续运行(≥ 30 d)。

(2)3D回旋仪原理:3D回旋仪从中国科学院国家空间科学中心处购买(图1A),模拟微重力效应的原理和方法参见文献[30]。简单的来说,生物体虽然在回旋器上受到重力的作用,但是由于360°旋转,所受到的重力是恒定的矢量作用,方向连续不断的进行着改变,转动1周(360°)所产生的矢量和等于“0”,即“零”重力。因此,3D回旋仪能够模拟微重力效应。

(3)生存盒介绍:为了保证小鼠在3D回旋仪上不受限制,设计了使小鼠自由活动的生存盒(图1B),1表示小鼠的自由移动区域,2表示小鼠的休息区域,3表示食物和固体琼脂(提供水分)供应区域。

(4)适应性训练和样本收集:实验最初待小鼠适应周围环境1周后,直接将小鼠放置在3D回旋仪上进行处理,观察到有小鼠死亡现象。其次,宇航员在太空中会加强锻炼以克服失重带来的不良反应,增加肌肉和骨骼强度(本研究采用休息1 d代替锻炼)。因此,在本研究中将实验操作流程进行了改良。作为初步探究,将CS组小鼠放在回旋仪上1 d,休息1 d。在整个实验过程中,我们团队有一位专业的兽医每天观察小鼠的状态。幸运的是,并未观察到小鼠有死亡现象,也没有观察到小鼠有应激反应(见图1C、1D)。

适应性训练过程如下:CS组小鼠置于3D旋转仪上的生存盒中,生存盒内装有食物和固体琼脂。CS组进行适应性训练5 d,适应时间为分别为1、2、4、8、12 h,休息2 d后开始研究。CS组小鼠在回旋仪上模拟微重力1 d,休息1 d;SB组小鼠一直被放置在生存盒里;MC组一直放置在单独通风笼中。3组同时进行实验,实验周期为12周。实验结束后取小鼠血清和左股骨。样本收集前腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠。左股骨用盐水浸泡纱布包裹,-20℃保存用于Micro-CT分析,血清-20℃保存用于代谢组学分析。

1.2.2 Micro-CT检测

使用Micro-CT扫描仪(Inveon, Siemens,Berlin,德国)对小鼠左股骨进行扫描,扫描参数为:电压:60 kV,电流:400 μA,曝光时间800 ms。使用Inveon进行图像重建和数据分析,并进行骨骼参数的统计。

1.2.3 代谢组学分析

每100 g血清样本取400 μL至EP管中,加入200 μL提取液(甲醇∶乙腈=1∶1(v/v),含同位素标记内标混合物),充分涡旋提取血清中的代谢物,样 品 在 冰 上 孵 育20 min,然 后 在4℃ 14 000 r/min离心20 min。液相色谱-质谱分析:样品在100 μL的乙腈/水(1∶1,v/v)溶剂中溶解,转移到液相色谱瓶中。对于极性代谢物的非靶向代谢组学,使用四极飞行时间质谱(Sciex Triple TOF 6600)-电喷雾电离亲水性相互作用色谱法对提取物进行分析。液相色谱分离采用ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1 × 100 mm,1.7 μm粒径),HPLC流动相A(25 mm乙酸铵和25 mm铵水溶液)和HPLC流动相B(乙腈)梯度洗脱。流速0.4 mL/min,柱温25℃,自动进样器温度5℃,进样量2 μL。质谱仪在负电离和正电离模式下工作。设置ESI源条件:雾化器辅助加热器(Gas 1)= 60, 辅助加热器2(Gas 2)= 60,气帘气(CUR)= 30,离子源温度 600℃,离子喷雾电压(ISVF)± 5500 V。在自动MS/MS采集中,仪器采集的m/z范围为25 ~ 1000 Da,生产扫描的积累时间设置为0.005 秒/谱。生产扫描采集采用信息依赖型采集方式,选择高灵敏度模式。参数设置如下:碰撞能量固定为35 V,碰撞能量为 ± 15 eV;分簇电势60 v(+)和60 v(-);排除4 Da以内的同位素;每周期监测的候选离子:10个。

1.3 统计学分析

采用Student’st-test单变量统计分析和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)的多元变量统计分析,以P＜ 0.05表示具有统计学意义,并符合变量投影重要度值(variable importance in the projection,VIP)＞ 1,筛选出现显著差异的代谢物。对显著的差异代谢物进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)注释。使用Graph Pad Prism 9.0统计学软件进行数据处理,两组间比较采用t检验,P＜ 0.05表示数据具有统计学意义。

2 结果

2.1 3D回旋仪模拟微重力效应对C57BL/J小鼠骨小梁数量和间距的影响

整个实验过程中没有观察到小鼠有物理性损伤。图2展现了生存盒和3D回旋仪对小鼠骨小梁数量和骨小梁间距的作用。与MC组小鼠相比,SB组小鼠的骨小梁数量和骨小梁间距无显著性差异,提示生存盒不会对C57BL/J小鼠的骨参数产生干扰。与SB组小鼠相比,CS组小鼠的骨小梁数量显著升高(P＜ 0.05),骨小梁间距有升高趋势(P＜ 0.5)。提示使用3D旋转仪模拟微重力效应导致了C57BL/J小鼠骨丢失。

注:A:骨小梁数量;B:骨小梁间距;与SB组相比,CS组骨小梁数量显著性降低,**P ＜ 0.05;与SB组相比,CS组骨小梁间距明显升高,#P ＜ 0.5。 Figure 2 3D回旋仪模拟微重力效应对C57BL/J小鼠骨小梁数量和间距的影响Note.A.Trabecular number.B.Trabecular spacing.Compared with SB, trabecular number decreased significantly in CS, **P ＜ 0.05.Compared with SB, trabecular spacing increased in CS group, #P ＜ 0.5.Figure 2 Effects of microgravity effect simulated by 3D clinostat on bone parameters of C57BL/J mice

2.2 3D回旋仪模拟微重力对C57BL/J小鼠代谢组学的影响

通过OPLS-DA分析,得到CS组与SB组C57BL/J小鼠不同的代谢谱(图3)。OPLS-DA评分图在负向模式(R2Y = 0.955,Q2= 0.511)和正向

模式(R2Y = 0.648,Q2= 0.198)下,CS组和SB组表现出明显分离的现象(图3A,3B),表明该模型可靠、稳定(Q2＜ 0.5)。为了避免OPLS-DA拟合,采用排列检验来保证模型的有效性(图3C,3D)。结果表明模型未发生过拟合(R2= 0.9005, Q2=-0.3733和R2= 0.5857, Q2= -0.2436)。从图中可以观察到无论是负模式还是正模式,SB组和CS组之间的分离趋势良好。

注:A,B:分别为负模式和正模式OPLS-DA得分图;C,D:分别为负模式和正模式OPLS-DA置换检验;E,F:分别为负模式和正模式差异代谢物火山图;G:KEGG代谢通路。图3 模拟微重力对SB组和CS组代谢模式的影响Note.A, B.Orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) score in negative mode and positive mode.C, D.Statistical validation of the corresponding OPLS-DA models by permutation tests in negative mode and positive mode.E, F.Volcano plot in negative and positive modes.G.KEGG metabolic pathways.Figure 3 Effects of simulated microgravity on the metabolic pattern in the SB and CS groups

火山地图上红点表示上调的代谢物,蓝点表示下调的代谢物(图3E,3F)。黑点显示SB组和CS组小鼠的代谢物之间没有显著性差异。结果表明与SB组相比,CS组小鼠共有86种代谢物发生了显著性变化。为了全面了解在CS组小鼠中86种差异代谢物所涉及的代谢通路情况,利用KEGG富集分析,结果以气泡图的形式呈现(图3G)。结果表明86种代谢物参与了多种生化途径。根据差异代谢物富集分析的P值(气泡所在纵坐标和气泡颜色表示),观察到显著性差异最强的前5个代谢通路分别是:癌症中的中心碳代谢(central carbon metabolism in cancer),蛋白质的消化和吸收(protein digestion and absorption),矿物质吸收(mineral absorption),氨酰基-tRNA生物合成(aminoacyltRNA biosynthcisis)和氨基酸的生物合成(biosynthcisis of amino acids)等通路。从图3G中,观察到86种差异代谢物主要归属于消化系统。提示3D回旋仪模拟微重力效应引起了小鼠代谢产物及其代谢途径的变化。

3 讨论

为了探究3D回旋仪模拟微重力效应对C57BL/J小鼠骨骼和代谢的影响。本实验选择了临床上受微重力影响最大的骨小梁和代谢产物进行了研究。值得注意的是,在实验最初,3D回旋仪上的小鼠在进行实验时有死亡情况。究其原因发现,小鼠天性胆小,未经过熟悉的环境,直接进行3D回旋仪处理,易产生应激反应,从而导致小鼠的死亡。因此,本研究为了避免类似情况的发生,提前对小鼠在3D回旋仪上进行了训练。同时,为了最大程度模拟真实地空间飞行的状态,本实验设计了生存盒固定在3D回旋仪上,生存盒上的活动区和休息区为小鼠提供活动和休息的场所(图1)。生存盒可以恢复小鼠的生理状态并进行活动跟踪。为了研究生存盒是否影响小鼠的骨参数,将MC组和SB组小鼠的骨参数结果进行了比较。结果表明,两组间骨小梁数量和骨小梁间距并无显著差异(图2)。

图2的结果表明,3D回旋仪模拟微重力效应致使C57BL/J小鼠骨小梁数量减少,间距增加。与真实的微重力引起的结果一致。骨在组织中非常独特,它的大部分体积由矿化的细胞外基质组成[31]。从结构上看,骨主要有2种类型[32]:皮质骨和松质骨(又称小梁或海绵骨)。由于松质骨的表面积相对于其体积来说非常大,因此通常首先且最显著的影响是内分泌状态的改变或机械负荷的减少。

越来越多的研究表明骨小梁数量和连接是骨强度和力学能力的关键因素[33-35]。研究发现[36-38]骨小梁是承担机械载荷的主要结构之一。骨小梁可以增强骨骼的机械强度[39-41]。在持续载荷作用下,骨小梁随时间变化发生力学改变[42-44]。在太空飞行后的人类和动物模型中,骨结构(即骨小梁)减少,导致在恢复重力载荷时骨折的风险增加[22]。在大多数太空飞行研究中观察到骨形成减少,而在人类和啮齿类动物模型中骨吸收增加[45-52]。一项研究发现[50],在航天飞机STS-108飞行过程中,9周龄的小鼠在大约飞行13 d后,骨形成显著减少,骨吸收增加。提示在研究中,骨小梁数量的减少和骨小梁间距的增加可能是骨形成减少和骨吸收增加共同作用的结果。

图3的结果观察到影响最多的代谢通路与消化系统有关。蛋白质消化和吸收是指蛋白质在体内经过消化后被水解成氨基酸再被吸收,重新合成人体所需的蛋白质[53-55]。与此同时,新的蛋白质不断代谢和分解,始终处于动态平衡。此前有研究表明[56],骨量的获得依赖于膳食蛋白质的摄入和消化,其次是游离氨基酸的吸收。膳食蛋白质摄入促进骨生长,延缓骨流失[57]。Ammann等[58]观察到,在喂食等热量低蛋白质饲料的去卵巢成年大鼠中,膳食必需氨基酸补充剂通过影响骨量和骨微结构来增加骨骼强度。钙、磷、镁等矿物质是骨骼和牙齿形成的重要原料[59-63]。例如磷是人体内最丰富的矿物质之一[64]。如果这种矿物质的含量不够高,血管的入侵和新骨的生成就会被阻断,导致佝偻病,并延迟生长。因此,长期的太空飞行会影响蛋白质、矿物质的消化和吸收,导致骨质流失。提示3D回旋仪模拟微重力效应引起C57BL/J小鼠代谢物和代谢通路的变化,涉及最多的是与消化系统相关的通路。

目前,鼠尾悬吊模型是常用的模拟微重力的模型之一。鼠尾悬吊模型采用尾部悬挂,头朝下倾斜,推荐角度30°,后肢离地不再负重,前肢承受躯体50%的体重[65]。例如,Liang等[66]利用尾悬吊小鼠探究了在微重力条件下,钙蛋白酶激活通过P38和ERK1/2 MAPK通路介导小鼠心肌异常。但是,该模型让动物身体的一部分仍然处于悬空状态,身体其余部分仍接触笼子,可能对结果产生影响[67]。在真实的失重状态下,宇航员整个身体都漂浮在空中,由于失去重力而失重。同时尾悬吊模型的使用时间限制为2个月,因此,无法长期对微重力展开研究[67]。本实验使用3D回旋仪模拟微重力效应建立小鼠模型使得小鼠整体处于失重状态,且无研究时长限制,能够真实的模拟微重力效应。目前本实验研究还在初步探索阶段,3D回旋仪模拟微重力效应除对小鼠骨小梁和代谢组学的影响外,对其他组织器官是否有病理性影响还值得继续探究。