汪化文，申仑，张绍义，郭淑娟

冠状动脉钙化是钙盐在冠状动脉壁上沉积的病理改变［1］。研究表明，钙化是冠状动脉粥样硬化、高血压等疾病的共同的标志性病理表现［2-3］。钙化在一定程度上可预示冠心病的发生和严重程度，也是病人发生心肌梗死等急性心血管事件的重要预测因素［4］。因此早期筛查冠状动脉钙化对预防心血管疾病发生有重要意义。研究认为，炎症反应增加是冠状动脉钙化发生的重要影响因素。有研究表明，长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在动脉粥样硬化病人血浆中表达下调，与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎性因子分泌增加有关，可能通过影响炎症反应参与疾病进展调节［5］。心肌梗死模型小鼠心肌组织中微小RNA-21（miR-21）表达显著升高，与单核细胞/巨噬细胞产生的TNF-α、IL-1β等炎性因子表达水平升高密切相关，可调控小鼠心脏功能障碍［6］。由于LncRNA MEG3、miR-21在冠状动脉钙化进展中研究较少，且LncRNA MEG3与miR-21在其他疾病中已被证实有相互作用机制［7］，本研究拟通过检测血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平，分析二者与冠状动脉钙化发生关系，并探究二者对冠状动脉钙化发生的评估价值，以期为临床早期准确评估冠状动脉钙化发生发展提供一定帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年6月至2019年6月在邯郸市中心医院行冠状动脉造影及CT检查确诊为冠状动脉钙化病人189例作为研究对象（钙化组），其中男性104例，女性85例，年龄（61.58±8.13）岁，范围51～73岁。另选取同期在该院行冠状动脉造影及CT检查显示无冠状动脉钙化者183例作为未钙化组，其中男性94例，女性89例，年龄（60.69±7.82）岁，范围49～72岁。纳入标准：①钙化组Agatston积分＞0分［8］；②未钙化组Agatston积分=0［8］；③临床资料完整。排除标准：①合并患有心肌梗死、严重心力衰竭者；②肝、肾功能严重不足者；③合并患有感染性疾病、甲状腺疾病、恶性肿瘤者。本研究获邯郸市中心医院伦理委员会批准（批号20180425），病人或其近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂实时荧光定量PCR（qRTPCR）仪（美国ABI公司，型号7500）、RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，货号RP2401）、反转录试剂盒（美国Qiangen公司，货号205311）、qRT-PCR试剂盒（美国Qiangen公司，货号208152）、TNF-α酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（德国IBL公司，货号JK-00018）、IL-1β ELISA试剂盒（德国IBL公司，货号BE45111）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 所有受试者于入院检查时清晨空腹采集外周静脉血5 mL，在4℃、3 000 r/min（离心半径14.5 cm）条件下离心10 min，收集上清液（即血清）于无菌EP管中，在-80℃环境下保存。

1.3.2 一般资料收集 所有受试者于入院检查时收集年龄、体质量指数（BMI）、血钙、血磷、血肌酐（SCr）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、糖化血红蛋白（HbA1c）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）等一般资料。

1.3.3 血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平检测 采用qRT-PCR法检测血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平。采用Trizol法提取总RNA后，使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，用于qRTPCR。qRT-PCR 20 μL反应体系如下：cDNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，SYBR®Primix Ex TaqTM10 μL，ROX 0.4 μL，DEPC水3.6 μL。反应步骤如下：95℃、8 min，1个循环；95℃、15 s，62℃、38 s，73℃、15 s，40个循环，一个样品设置三个重复。采用2-ΔΔCt法计算LncRNA MEG3、miR-21相对表达水平。实验所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 血清TNF-α、IL-1β表达水平检测 采用ELSIA法检测血清TNF-α、IL-1β表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法使用SPSS 19.0软件对本文中数据进行分析，计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料用例（%）表示，用χ2检验；采用Pearson法分析冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平及与HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相关性；采用logistic回归模型分析冠状动脉钙化发生的影响因素；采用受试者工作特征曲线（ROC）评估血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平对冠状动脉钙化的预测价值。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 钙化组与未钙化组一般资料比较钙化组与未钙化组年龄、BMI、血钙、血磷、SCr、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平及性别、糖尿病、高血脂症比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。钙化组血清HbA1c、hs-CRP水平及冠心病、高血压比例均明显高于未钙化组（P＜0.05）。见表2。

2.2 钙化组与未钙化组血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表达水平钙化组病人血清LncRNA MEG3表达水平明显低于未钙化组，血清miR-21、TNF-α、IL-1β表达水平明显高于未钙化组（P＜0.05），见表3。

表3 冠状动脉钙化189例与无冠状动脉钙化183例血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表达水平比较/

表3 冠状动脉钙化189例与无冠状动脉钙化183例血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表达水平比较/

注：LncRNA MEG3为长链非编码RNA母系表达基因3，miR-21为微小RNA-21，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白细胞介素-1β。

组别钙化组未钙化组t值P值例数189 183 LncRNA MEG3 0.62±0.17 1.01±0.31 15.11＜0.001 miR-21 2.87±0.93 1.02±0.29 25.73＜0.001 TNF-α/（ng/L）11.72±3.92 9.82±4.13 4.55＜0.001 IL-1β/（ng/L）4.96±0.95 2.32±0.74 29.84＜0.001

2.3 冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3与miR-21表达水平相关性冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3与miR-21表达水平呈负相关（r=-0.32，P＜0.001）。见图1。

图1 冠状动脉钙化病人血清长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）与微小RNA-21（miR-21）表达水平相关性

2.4 冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平与HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相关性冠状动脉钙化病人血清LncRNAMEG3与hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈负相关，血清miR-21与hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈正相关（P＜0.05），见表4。

表4 冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平与HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相关性

2.5 冠状动脉钙化发生的影响因素分析以本研究资料为样本，以是否发生冠状动脉钙化为因变量（发生=1，未发生=0），以表2，表3中两组差异有统计学意义（P＜0.05）的冠心病、高血压及HbA1c、hs-CRP、LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β水平等8个指标为自变量建立logistic回归模型，通过采用方差膨胀因子分析自变量之间的多重共线性分析显示，本研究所纳入的自变量方差膨胀因子均＜10，所以不存在多重共线性，可进行logistic回归分析。经二元logistic回归分析显示，冠心病、LncRNA MEG3水平、miR-21水平是影响冠状动脉钙化发生的危险因素（P＜0.05）。见表5。

表2 冠状动脉钙化189例与无冠状动脉钙化183例一般资料比较

表5 冠状动脉钙化发生的影响因素的logistic回归分析

2.6 血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平对冠状动脉钙化的预测价值分析血清LncRNA MEG3预测冠状动脉钙化的曲线下面积为0.84［95%CI：（0.79，0.87）］，当血清LncRNA MEG3取截断值0.83时，其诊断灵敏度为78.19%，特异度为87.43%。血清miR-21预测冠状动脉钙化的曲线下面积为0.82［95%CI：（0.78，0.86）］，当血清miR-21取截断值1.81时，其诊断灵敏度为81.48%，特异度为73.77%。血清LncRNA MEG3、miR-21联合检测预测冠状动脉钙化的曲线下面积为0.88［95%CI：（0.84，0.91）］，灵敏度为84.13%，特异度为85.79%。见图2。

图2 血清LncRNA MEG3、miR-21表达水平对冠状动脉钙化的预测价值的ROC曲线

3 讨论

血管平滑肌细胞表型转化是血管钙化发生的重要机制，在炎症反应刺激下，来源于间充质干细胞的血管平滑肌细胞可转化为成骨细胞，通过产生骨基质蛋白促进矿化进程并沉积于血管［9］。表明炎症反应增加和血管平滑肌细胞表型转化是冠状动脉钙化发生的重要影响因素。

LncRNA MEG3是一种长度大于200 nt的长链非编码RNA，已被证实可通过调控相关通路在肿瘤进展中起抑制作用［10］。Bai等［11］研究发现，冠心病病人动脉组织中LncRNA MEG3表达水平下调，过表达LncRNA MEG3可通过抑制血管平滑肌细胞增殖、促进细胞凋亡参与动脉粥样硬化进展调控。本研究结果显示，钙化组病人血清LncRNA MEG3表达水平明显低于未钙化组，提示LncRNA MEG3在冠状动脉钙化发生时呈低表达，可能与血管平滑肌细胞代谢异常有关。有研究报道，LncRNA MEG3在肺部细菌感染小鼠模型中下调，过表达时可靶向抑制IL-1β等炎性因子表达减缓小鼠的肺部炎症反应［12］。强直性脊柱炎病人血清中LncRNA MEG3低表达，可靶向TNF-α、IL-1β发挥抗炎作用［13］。本研究中，冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3与hs-CRP、TNF-α、IL-1β 水平呈负相关，提示LncRNA MEG3可能通过调控hs-CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子表达促进炎症反应进展，进而影响血管平滑肌细胞转化等促进冠状动脉钙化发生。

miR-21是一种短链非编码RNA，在乳腺癌、高血压肾损害等疾病中具有调控作用［14-15］。有研究发现，miR-21可通过调控血管平滑肌细胞增殖和迁移影响血管内皮功能［16］。Vahed等［17］研究报道，冠脉狭窄病人外周血单个核细胞中miR-21表达水平明显升高，可能通过影响血管生成、白细胞黏附、炎症反应等生物学过程促进冠脉疾病的发生和进展。本研究结果显示，与未钙化组相比，钙化组血清miR-21表达水平明显升高，提示miR-21表达水平上调可能预示冠状动脉钙化发生。有研究表明，miR-21可通过调控骨桥蛋白等表达影响血管平滑肌细胞表型转化，参与动脉粥样硬化发生发展［18］。推测冠状动脉钙化发生时miR-21高表达可能与血管平滑肌细胞表型转化有关。又有研究表明，miR-21定位于心脏组织中的炎性细胞，是急性心脏损伤大鼠心脏炎症浸润的潜在生物标志物［19］。脓毒症病人外周血中miR-21表达水平升高，可能靶向激活NLRP3等炎性小体分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子介导脂多糖诱导的细胞焦亡过程［20-21］。本研究结果显示，血清miR-21与hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈正相关，提示miR-21在冠状动脉钙化发生进展中可能通过调节炎症反应增加诱导血管平滑肌细胞转化等。

Zhu等［7］研究发现，LncRNA MEG3在肺动脉平滑肌细胞中表达下调，正常或缺氧状态下抑制MEG3均可通过靶向调控miR-21/PTEN表达促进细胞增殖和迁移。本研究结果显示，冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3与miR-21表达水平呈负相关，提示LncRNA MEG3在参与冠状动脉钙化发生时可能通过影响miR-21表达发挥作用，但具体机制尚需进行进一步验证。

进一步研究发现，LncRNA MEG3、miR-21水平均是影响冠状动脉钙化发生的危险因素，血清LncRNA MEG3、miR-21联合检测预测冠状动脉钙化的曲线下面积为0.88，灵敏度为84.13%，特异度为85.79%，提示二者对冠状动脉钙化发生的预测价值较高，临床可关注二者变化，以提高冠状动脉钙化的早期诊出率。

综上所述，冠状动脉钙化病人血清LncRNA MEG3表达水平明显降低，miR-21表达水平明显升高，二者可能作为生物标志物，共同预示冠状动脉钙化发生。但由于本研究仅从表达层面分析二者在冠状动脉钙化中的作用，具体作用机制还需进一步进行动物、细胞等实验进行验证。