潘巧文，武军艳，马学才，王亚林，马 骊，徐新宇，李 鹏，姚彦林，徐 芳，崔小茹，孙万仓

(1. 甘肃农业大学农学院，甘肃省油菜工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070；2. 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730070；3. 甘肃省农业技术推广总站, 甘肃 兰州 730070)

在自然界中，生长素是人们发现的第一种植物激素，在调控植物发育并响应外界环境刺激时可以通过诱导生长素早期响应基因的快速高表达来促进植物的抗性；生长素早期的应答基因有Aux/IAA(Auxin/indole-aceticacidsproteins，Aux/IAAs)、GH3 (GretchenHagen3)和SAUR(Smallauxin-upRNAs)[1]。SAUR是对生长素反应最快、最强烈、响应程度最大的植物特异性基因家族，它们可以在2～5 min内产生响应[2]。SAUR基因大部分聚集分布在染色体上，一般没有内含子[3]，大多数在启动子区包含一个或多个生长素应答元件，编码的蛋白质分子量相对较小，生长素诱导后可以快速合成，从而对逆境胁迫做出响应[4]。

作为生长素早期响应基因之一，了解SAUR在植物发育中的作用具有重要意义。目前在拟南芥中检测到了72个SAUR基因，水稻[5]中有58个，葡萄[6]中有64个，白菜中有143个[7]。相关研究表明，白菜SAUR基因家族之间的分化扩增是导致大量基因重复的因素之一，而且已证实白菜SAUR基因间的表达模式存在较大差异，即这些基因的功能可能已经发生分化[8]。SAUR的转录本主要存在于干细胞和根、茎中，可能作为信号分子以某种未知的方式在维持生长素水平、调节生长素运输和细胞扩张方面发挥重要作用，这使得探索SAUR整个基因家族的功能具有重要意义[9]。

油菜是甘肃省第一大油料作物，种植面积18万hm2左右，由于生态环境多样、地域差异大，因此甘肃省冬、春油菜均有种植，其中冬油菜种植面积近11万hm2[10]。白菜型冬油菜是甘肃省冬油菜产区的主要栽培类型，在越冬前，随着温度的降低，其叶片逐渐干枯，返青后在生长点(顶端分生组织)重新长出新叶完成其生殖生长[11]。植物生长素主要是在顶端分生组织中合成，之后被运输到植物体的各个部分[12]，在此过程中，SAUR基因作为植物早期生长素响应基因家族，在生长素诱导的酸性生长中起着核心作用[13]。因此，本研究鉴定了白菜型油菜的SAUR基因信息，通过转录组测序初步分析了其在白菜型冬油菜生长点的表达特性，筛选差异表达基因，比较不同胁迫处理下差异表达基因在白菜型冬油菜品种中的相对表达量，探究生长素早期应答基因调控白菜型冬油菜生长点发育的机理，旨在为后期研究白菜型油菜SAUR的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以甘肃农业大学提供的强抗寒性白菜型冬油菜品种陇油7号(L7)和弱抗寒性冬油菜品种陇Lenox(X)为试验材料。

1.2 试验设计

1.2.1 基因家族鉴定、理化性质及进化分析 参照李婉雪等[14]的方法得到鉴定基因的相关信息。用Expasy Protparam 软件预测SAUR家族成员的所有氨基酸序列、分子量、等电点及疏水性等。通过在线软件Plant-mPLoc对SAUR进行亚细胞定位预测。用MEGA 7.0绘制基因家族进化树。

1.2.2 基因结构和氨基酸保守序列分析 参照武军艳等[11]方法分析SAUR家族的保守基序，寻找motif的数量为10、宽度在15～41个氨基酸之间。用基因结构显示服务器GSDS进行绘制。

1.2.3 基因家族成员在染色体上的定位 用MapChatr软件绘制基因位置与染色体位置。

1.2.4 基因家族启动子区顺式作用元件分析 提取白菜型油菜中鉴定到的SAUR基因编码区上游1.5 kb的序列，参照李珊等[15]的方法分析顺式作用元件，用GSDS绘图。

1.2.5 基因家族同源关联分析 参照马倩等[16]的方法进行共线分析。

1.2.6 白菜型冬油菜SAUR基因家族表达模式分析 挑选L7和X的干净、饱满种子，蒸馏水清洗除杂后，置于覆盖两层水浸滤纸的玻璃培养皿中，室温下待其露白后选取健壮幼苗移栽至花盆中，在人工培养箱中培养(24℃，光照12 h，黑暗12 h)，每个品种10盆，每盆4株幼苗，当幼苗生长至3～5叶期时进行胁迫处理。

(1)取长势均匀一致的3盆，转移至4℃低温培养箱(光照12 h，黑暗12 h)，分别于0(CK)、3 、24 h取相同部位的生长点，每个处理3次生物学重复，用蒸馏水清洗、滤纸干燥，立即液氮冷冻后送至上海欧易生物有限公司进行转录组分析。

(2)低温胁迫：每个品种各取长势均匀一致的3盆，转移至4℃低温培养箱(光照12 h，黑暗12 h)，分别于0(CK)、1、24 h取样。PEG模拟干旱胁迫：各品种挑选长势一致的3盆，从根部灌入250 ml 20% PEG营养液，分别于0(CK)、1、24 h取样。低温与干旱胁迫取样组织均为油菜叶片和生长点，每个处理3次生物学重复，用蒸馏水清洗、滤纸干燥，立即液氮冷冻，在-80℃冰箱中保存备用。

(3)RNA提取：按照Steady Pure植物RNA提取试剂盒(AG21019 )说明书方法提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。根据TaKaRa-cDNA第一链合成试剂盒(RR036A)进行反转录得到cDNA，-20℃保存备用。以上两种试剂盒均购自天根生物科技有限公司。

(4)荧光定量引物设计：从鉴定获得的白菜型油菜SAUR基因家族的序列文件中提取CDS序列，通过Primer 5.0软件设计荧光定量特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，参考基因为已报道的稳定表达的内参基因Actin。

表1 荧光定量引物序列

1.3 数据处理

用Excel和SPSS软件分析。

2 结果与分析

2.1 BraSAUR基因家族的鉴定和蛋白质理化性质分析

从白菜型油菜基因组中鉴定出142个SAUR基因，分别命名为BraSAUR001～BraSAUR142。理化信息分析结果表明，该家族基因编码的蛋白质分子量从6750.8 Da到23271.3 Da，蛋白质等电点从4.58 (Bra002330)到11.40(Bra029452)，其中111个蛋白质偏碱性，30个偏酸性，1个(Bra012231)为中性，可见，BraSAUR基因编码的蛋白质大多数偏碱性，接近酸性蛋白质的4倍。脂肪族指数在61.26～100.38之间，表明脂肪链在蛋白质中所占比重高，均为脂溶性蛋白。疏水性预测得出大多数蛋白亲水性好，亲水蛋白是疏水蛋白的6倍。不稳定指数的预估结果表明，有33个蛋白在体外是稳定的，其他蛋白不稳定指数均大于40。亚细胞定位预测表明，87个家族成员位于细胞核内，48个位于细胞质内，7个位于叶绿体内。

2.2 BraSAUR基因结构及系统进化树分析

142个BraSAUR基因大多数的cDNA长度在500 bp以内。131个不含有内含子，只有一个长度500 bp以内的外显子，90%的长度相近，比较保守；11个基因有内含子。BraSAUR基因分为4个亚家族 (Group1～ Group 4)：Group1(36个)、Group2(14个)、Group3(7个)、Group4(85个)(图1，见7页)。各个亚家族基因的分化从刚开始的均匀对称分支，再到之后的偏向不均等分支分化。这种偏向可能与该物种在进化过程中经历的自然选择有关。

图1 BraSAUR基因家族成员的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of members of BraSAUR gene family

2.3 BraSAUR基因家族的定位

BraSAUR基因分布在10条染色体上，见图2。3号染色体上分布的基因最多，有26个，1号染色体上12个，2号染色体上22个，4号染色体上7个，5号染色体上8个，6号染色体上9个，7号染色体上11个，8号染色体上13个，9号染色体上14个，10号染色体上17个。

图2 1～10号染色体上BraSAUR基因的定位(a) 及各染色体上的基因数量(b)Fig.2 Location of BraSAUR gene on chromosomes 1～10(a) and Quantity of genes on each chromosome(b)

2.4 BraSAUR蛋白保守氨基酸序列分析

BraSAUR含有的氨基酸保守基序数量和种类不同(图3)，共有10个motif序列。蛋白的保守氨基酸基序从5’-3’方向出现的前后顺序是motif 6、motif 4、motif 1、motif 3、motif 7、motif 5 、motif 2、motif 10、motif 8和motif 9。家族蛋白中一半以上都含有motif 2，但motif10只在6个蛋白中出现。各个亚家族成员结构相似，蛋白的保守结构域也相似。

图3 BraSAUR家族基因编码蛋白保守motif序列Fig.3 Conserved motif structure of proteins encoded by BraSAUR family genes

2.5 BraSAUR家族基因的启动子分析

预测启动子区域的顺式作用元件，得到许多响应环境信号、激素响应因子和转录调控位点在内的顺式元件。每个成员包含多个顺式作用元件，共同调控着基因的表达，在不同的外界信号刺激下发挥不同的作用。由图4中看出不同亚家族中含有作用元件的种类相同，数量上有所差别。大多数BraSAUR基因含有调控转录的重要功能位点。

2.6 BraSAUR基因家族成员同源复制分析

除了A1和A8染色体没有发现共线基因(图5)，其余8条染色体上的26个基因发生了17组共线关系，A3染色体上5个基因发生了7条共线关联；相邻近染色体(A2、A5)和远端染色体(A9、A10)都存在串联重复，A3(Bra023055)与A5(Bra005223、Bra005293)和A9(Bra006984)都有基因串联复制关系。A6(Bra024482)与A7(Bra039909)和A9(Bra037243)存在两两复制。串联复制基因占基因家族的20%，表明部分BraSAUR可能是基因关联复制产生，复制事件是基因家族扩张的重要方式之一。

BraSAUR基因与同科植物拟南芥同源基因有80个，在拟南芥5条染色体上都存在共线性关系(图6，见10页)。其中拟南芥4号染色体上的基因与所有BraSAURs都有共线关联，共线的基因数目最多。

图6 BraSAUR基因与拟南芥AtSAUR基因同源共线分析Fig.6 Analysis of homology and collinearity among BraSAUR and AtSAUR

2.7 BraSAURs表达模式分析

2.7.1BraSAURs基因的转录分析 为了研究BraSAURs基因在白菜型冬油菜中的低温响应，分析了它们在不同抗寒性品种生长点的转录表达情况。结果表明，84个BraSAURs基因在两个品种中均不表达(图7)。在强抗寒性品种L7中，Bra017676和Bra033581在低温处理3 h时上调表达明显，在处理24 h时Bra034651、Bra006577和Bra020128等表达上调；Bra025981、Bra016493等则随着低温处理时间的延长下调表达。在弱抗寒性品种X中，低温处理3 h时Bra026044和Bra000497表达上调，Bra027984下调表达，处理24 h时Bra017680、Bra006430、Bra011563、Bra002131和Bra008209等下调表达(图7)。挑选了14个差异表达显著的基因，其中上调表达基因6个(Bra09452、Bra000497、Bra010501、Bra020128、Bra006577、Bra034651)，下调表达基因8个(Bra011563、Bra008209、Bra002131、Bra015831、Bra00643、Bra025981、Bra017680、Bra033581)做qRT-PCR验证。

2.7.2BraSAURs基因在低温胁迫下的表达 白菜型冬油菜在其整个生产过程中经常面临冷害和冻害的威胁。因此用抗寒性不同的油菜品种L7和X，通过4℃胁迫，取其叶片及生长点组织，分析选取的14个BraSAURs基因的相对表达量。

(1)在叶片中的表达。在强抗寒性品种L7中，1 h有5个基因表达上调，至24 h有13个基因表达上调，且上调倍数较大(图8)。在弱抗寒性品种X中，1 h时11个基因表达上调，到24 h时12个基因表达量均低于对照。可见在X中1 h表达量高的基因数目多于24 h，而在L7中却相反。在两个品种中，与对照相比Bra029452表达量差异最明显，在24 h时，L7中的表达量是X的24倍。

(2)在生长点中的表达。生长点是冬油菜越冬的重要部位。低温胁迫后，在L7中各基因1 h的表达量均低于24 h，而在X中，有10个基因1 h的表达量均高于24 h(图9)；可见在弱抗寒性品种中基因表达对低温的反应更迅速。其中Bra029452、Bra011563、Bra010501和Bra033581在L7中24 h的表达量显著上调(P<0.05)。低温胁迫后Bra010501在两个品种中都高表达；在L7中是递增，到24 h时是对照的4倍，在X中是先增加后降低。

图9 低温胁迫下 BraSAURs基因在生长点中的相对表达量Fig.9 Relative expression of BraSAURs gene in grow core(gc) under low temperature stress

2.7.3BraSAURs基因在PEG模拟干旱胁迫下的表达

(1)在叶片中的表达。随着胁迫时间的延长，Bra002131、Bra010501、Bra015831和Bra006577在两个品种中的表达趋势相似(图10)；Bra029452在L7中表达量逐渐增加，且与CK比较，1 h和24 h均差异显著(P<0.05)，但在X中则是逐渐降低。Bra020128则刚好相反，在L7中表达量逐渐降低，但在X中则是逐渐升高。

图10 PEG干旱胁迫下BraSAURs基因在叶片中的相对表达量Fig.10 Relative expression of BraSAURs gene in leaves under PEG drought stress

(2)在生长点中的表达。随着干旱胁迫时间的延长，有11个基因在两个品种中表达趋势相似(图11)。Bra029452在L7中表达量先升高然后降低，与CK比较，1 h和24 h均差异显著(P<0.05)，但在X中则是先降低后升高。Bra000497在L7中表达量逐渐降低，在X中则是逐渐升高。

图11 PEG干旱胁迫下BraSAURs基因在生长点中的相对表达量Fig.11 Relative expression of BraSAURs gene in grow core(gc) under PEG drought stress

3 讨 论

随着全基因组测序的完成，拟南芥、水稻、马铃薯、玉米、桑树、葡萄及西瓜[13，17-21]中的SAUR基因家族均已鉴定。本研究从白菜型油菜全基因组中鉴定出142个SAUR基因，与其他已报道的物种相比，白菜型冬油菜中的SAUR基因数目偏多，说明白菜型冬油菜的SAUR基因在进化过程中经历了大量的基因扩张。白菜型冬油菜SAUR基因中20%的SAUR基因存在着串联重复与片段重复，这可能是因为白菜型油菜在几百万年以前发生了加倍事件，这种基因组加倍导致了SAUR基因家族的扩张分化[22]。

拟南芥中只有1个基因含有内含子[4]，水稻中所有SAUR基因都不含内含子[9]。玉米[18]中3个基因、番茄[19]中3个基因、马铃薯[13]中9个基因、黄瓜[13]中6个基因含有内含子。白菜型冬油菜的SAUR基因也存在这种现象，有11个基因存在内含子，占总家族数量的7.74%，无内含子的基因占92.26%；一般情况下无内含子的基因可变剪切的发生率往往很低[22]，因此SAUR家族基因的功能可能会相对保守一些。本研究中大多数基因至少存在一种激素响应元件，如赤霉素响应元件，说明该基因参与植物赤霉素调控的生理活动[23]。BraSAUR家族包含特异的80～120个氨基酸组成的保守结构域，该结构域包含生长素超家族基因的重要组成成员，这种现象在马铃薯[13]、拟南芥[24]、水稻[9]与玉米[25]中也有报道。

本研究中低温胁迫后两个品种的不同组织有不同的响应，强抗寒性品种L7的叶片及生长点组织对低温均响应较慢，到胁迫24 h时基因表达呈现出显著变化；而弱抗寒性品种X的叶片和生长点组织对低温的响应均比较灵敏，1 h时基因表达即发生显著变化，快速对胁迫做出响应，这与Zeng等[26]的研究结果相似。此外，在两个品种中均表现为胁迫后生长点组织中显著表达的基因数目多于叶片，这与赵玉红等[27]的研究结果有类似之处。这种现象可能与白菜型冬油菜的表型有关，强抗寒性品种L7下胚轴短，生长点凹陷、低于地表，叶片匍匐生长，而弱抗寒性品种X下胚轴长、生长点高于地表，叶片直立、半直立生长[28]。本研究发现低温胁迫后诱导表达的BraSAUR基因比干旱胁迫的多，且表达量高，说明在白菜型冬油菜中SAUR基因可能在应对低温胁迫中起主要作用。本研究中分别在低温胁迫和干旱胁迫条件下，发现Bra029452基因表达在强抗寒性油菜品种L7的叶片及生长点中均逐渐升高(除在干旱胁迫条件下L7生长点中呈现先升高后降低的趋势外)，可推断该基因同时参与白菜型冬油菜耐受低温、干旱的调控过程。因此，这个基因如何响应白菜型油菜的逆境胁迫可作为下一步的研究工作。

4 结 论

白菜型油菜有142个SAUR家族成员，在10条染色体上都有分布，呈现簇状分布，其中3号染色体上数量最多；其基因长度较短，只有11个基因有内含子。低温胁迫后，BraSAUR基因在X中1 h表达量高的基因数目多于24 h，而在L7中却相反，可见在弱抗寒性品种中其对低温的反应更迅速。干旱胁迫后，Bra029452在两个品种的叶片及生长点中均存在差异，在L7的叶片中表达量逐渐增加，但在X中则是逐渐降低；而在L7的生长点中表达量先升高然后降低，在X中则是先降低后升高。低温胁迫后诱导表达的BraSAUR基因比干旱胁迫的多，且表达量高。