黄嘉文

（广州美神生物科技有限公司，广东广州 510670）

胶原蛋白约占人体总蛋白的28%，属于人体分布最为广泛的功能性蛋白，其具有良好稳定性，备受相关产业关注，但胶原蛋白结构复杂且类型多样，故在分离提取与生产重组中存在一定困难。随着科技的不断进步，可运用基因工程技术进行胶原蛋白的生产重组，在先进技术驱动下，重组胶原蛋白生产量有所提升，对于胶原蛋白的生产重组开发研究项目逐渐推进。

1 胶原蛋白结构分析

胶原蛋白由多个原胶原构成，各原胶原均由三条α-螺旋肽链组成，各肽链长约一千个氨基酸残基，三条α-螺旋肽链缠绕而形成了三重螺旋结构[1]。胶原左旋α链仅螺旋缠绕构成的复合螺旋结构被称为螺旋区段，其最大特征在于周期性排列。在胶原蛋白结构中，羟脯氨酸、脯氨酸占比最高，可达25%，此外，羟基赖氨酸仅存在于胶原蛋白结构中，其他蛋白质均不含有羟基赖氨酸，且羟基赖氨酸无法参与生物合成，仅可从胶原肽链中转化获取。

2 胶原蛋白借助基因工程技术实现生产重组的方向

动物胶原蛋白存在不稳定性，且具有一定风险，为切实发挥出胶原蛋白的优势，主要探究基因工程技术生产重组人胶原蛋白的方式。现阶段基因工程技术在实际应用中，主要将转基因动植物、酵母、细菌、昆虫细胞作为宿主细胞进行人胶原蛋白的生产重组，可获得质量稳定、安全性好的胶原蛋白产品，解决了传统办法所存在的病毒隐患及免疫排异性问题。

2.1 动植物生产重组

将αS1-乳腺酪蛋白基因片段及胶原蛋白基因片段进行基因工程重组，以转基因鼠乳腺细胞作为宿主细胞，以此可获得人I型原胶原，在鼠乳三螺旋结构中，同型三聚体质量浓度可达8mg/mL[2]。通过该基因工程技术生产重组方式能够实现较高产量，但所获得的胶原蛋白羟脯氨酸含量不达正常水平的一半，结合该结果来看，推测乳腺P4H可对羟基化产生限制，此时可通过P4H转入编码降低该限制，从理论上看，可采用该方式获得大量重组胶原，但该方式并未完全消除安全隐患，故在实践生产重组中并未采用。

依托于基因工程技术，可应用基因注入办法进行表达重组，例如：结合转基因蚕丝腺来看，其长度较短，为1/3的人胶原蛋白长度，且因其丝腺内P4H成分活力较低，无法良好完成羟基化过程，导致胶原蛋白表达重组效果不佳，针对该现象，可依托于基因工程技术，采用基因注入的方式提升丝腺P4H活力，经处理后解决了脯氨酸无法充分羟基化的现象。在基因注入过程中，可将杆状病毒IE-1注入到丝腺中，通过该操作可提升蚕茧干质量，使蛋白结果能够直接分泌到蚕丝丝胶层，使胶原蛋白的纯化与提取更为便捷。

从植物角度来看，可将人胶原蛋白及P4H对应基因嵌入到烟草植株中，通过该基因工程技术操作，能够活动完整羟基化地重组胶原蛋白。在上述表达重组过程中，需借助瞬时表达技术完成胶原蛋白的表达重组，使修饰酶能够在烟草植株中完成表达，以此有效提高重组蛋白质量。除此之外，在现有研究中，现已实现了大麦重组表达重组胶原蛋白。从当前基因工程技术生产重组胶原蛋白产业发展来看，动植物细胞存在成本高、难度高的限制，无法实现规模化胶原蛋白生产，故从产业发展角度来看，宿主细胞选择微生物较为合适。

2.2 微生物生产重组

在现有研究中，可结合人胶原α1链胶原域序列特征提高胶原蛋白表达量，并以此为依据合成亲水性良好的重复序列基因单体，进一步采用同向串联的方式构建人胶原蛋白表达载体，并使其转化为毕赤酵母，以此完成人胶原蛋白的表达重组。此外，单体同向串联操作期间能够按时间需求获得不同的蛋白基因，且所表达重组胶原蛋白产物能够良好实现分离纯化，同时毕赤酵母生产周期短，从某种程度上降低了生产重组成本。将微生物作为宿主细胞时，可通过酶解工艺、冻干工艺、透析工艺、灭菌工艺制备人胶原蛋白，通过一系列处理可将胶原蛋白质量提升至99.8%，极大降低DNA残留量，胶原蛋白结构N末端、C末端肽浓度远低于检测限度[3]。通过上述工艺操作，对酶解工艺的端肽去除效果进行了验证，可在人胶原蛋白制备期间大幅降低其免疫原性。

对现有微生物表达重组胶原蛋白进行分析，发现适宜羟基化的胶原蛋白进行生产表达重组时，可将毕赤酵母作为宿主细胞，以此产生人胶原蛋白α1链，采用共同表达P4H的方法确保人胶原蛋白α1链中含有羟脯氨残基。为进一步验证该生产表达重组效果，可应用液相色谱-质谱/质谱分析法，选取重组胶原蛋白进行检测，以此获得羟基化脯氨酸表达情况。

胶原蛋白现已被广泛应用到化妆品、护肤品中，但在于皮肤吸收外用胶原蛋白的有效性方面仍存有一定争议，若外用胶原蛋白无法被人体皮肤良好吸收，将无法切实发挥出外用胶原蛋白的作用，且可造成一定资源浪费。针对这一问题，可应用基因工程技术生产重组人胶原蛋白，选取皮肤存在激光损伤的小鼠进行修复实验，以此了解外用胶原蛋白对人体皮肤的效果。在该实验的前期研究中，结合二次谐波及荧光成像方式，对重组人胶原蛋白皮肤吸收情况进行观察，通过实验发现，重组人胶原蛋白能够沿毛囊逐渐进入皮肤真皮层，同时不断扩散到达胶原纤维层，借助人胶原蛋白实现人体皮肤胶原纤维的补充。在激光损伤下小鼠皮肤修复实验中，运用460～510nm的激光照射小鼠皮肤，在其背部造成激光损伤效果，此时将基因工程技术生产重组的人胶原蛋白均匀涂抹至小鼠激光损伤皮肤处，在实际涂抹处理时，运用生理盐水将人胶原蛋白配置为8mg/mL的剂量，按照每日涂抹一次，连续涂抹14d的修复方案进行涂抹。在人胶原蛋白涂抹后1d、4d、7d、14d进行观察记录，为实现精准化修复效果观察，需借助双光子显微镜检测小鼠背部激光损伤处的胶原纤维情况，为便于观察，可进行HE染色，以此直观化观察背部激光损伤处的病理学变化[4]。完成上述观察操作后检测胶原纤维细胞增殖活力情况，同时对细胞存活率进行计算。将对照组与实验组损伤处理效果进行对比，发现人胶原蛋白能够缩小皮肤损伤处的恢复时间，由此可证明，人胶原蛋白能够被皮肤良好吸收，其作用原理在于提升皮肤成纤维细胞的活力，并促进其增殖。结合上述实验可见，经基因工程生产重组的人胶原蛋白能够被皮肤良好吸收，且可对损伤皮肤起到一定修复效果。

3 重组胶原蛋白产品功效分析

STEE HILL溯华重组胶原蛋白紧致弹力套装由洁面乳、柔肤水、精华乳、精华液、面霜构成，其采用基因工程技术完成的胶原蛋白生产重组工作，为探究基因工程技术在胶原蛋白生产重组中的作用，了解重组基因蛋白在护肤品中的功效，本次选取STEE HILL溯华重组胶原蛋白紧致弹力套装进行检测。

3.1 测试概况

本次STEE HILL溯华重组胶原蛋白紧致弹力套装检测的主要目的是为验证产品的抗皱、保湿作用，间接验证经基因工程技术生产重组胶原蛋白的应用效果，通过验证相关产品功效而判断基因工程技术在胶原蛋白生产重组中的作用。在测试期间，需从皮肤角质层水分含量、皮肤皱纹数量、皮肤皱纹面积、皮肤皱纹长度四个方面进行测试，同时采用实验室专家评估法进行皱纹等级评分，该项评分存在一定主观性因素，故仅作为参考意见，此外，对受试者（共计31人）自我评估看法进行采集，发现套装内五款产品均获得了93.5%以上满意度，其中洁面乳更是达到了100%满意。在该次重组胶原蛋白紧致弹力套装检测中，发现该套装产品在使用14d后能够表现出优异的保湿效果，使用28d后即可表现出良好的除皱效果。

3.2 测试方案

STEE HILL溯华重组胶原蛋白紧致弹力套装样品主要作用于时受试者面部，每日早晚各使用一次，连续使用28d。产品的使用方法如下：每日洁面后，按照柔肤水、精华液、精华乳、面霜的顺序进行使用。对受试者基本信息进行采集，在本次测试实验中，受试者共计31人，均为女性，且年龄均处于30～50岁，受试者肤质要求如下：面部松弛、敏感肌肤、有皱纹者，皱纹评分1～3分，其中有8人为1级皱纹等级，15人为2级皱纹等级，10人为3级皱纹等级，角质层水分含量≤60c.u，皮肤弹性R2≤0.2，对受试者情况进行筛选，最终获得31名有效数据。

3.3 测试结果

从皮肤角质层水分含量来看，与使用样品前相比，31名受试者在使用样品14d后，脸颊部位皮肤角质层水分含量提升了5.23%，有显著性差异；在使用样品28d后，脸颊部位皮肤角质层水分含量提升了3.88%，无显著性差异。

从皮肤皱纹数量（见图1）来看，与使用样品前相比，31名受试者在使用样品14d后，眼底部位皱纹数量降低了28.32%，眼角部位皱纹数量降低了26.99%，有显著性差异；在使用样品28d后，眼底部位皱纹数量降低了30.11%，眼角部位皱纹数量降低了29.83%，有显著性差异。

图1 各时间点皮肤皱纹数量（P＜0.05）

从皮肤皱纹面积（见图2）来看，与使用样品前相比，31名受试者在使用样品14d后，眼底部位皱纹面积降低了10.03%，眼角部位皱纹面积降低了12.032%；有显著性差异；在使用样品28d后，眼底部位皱纹面积降低了10.82%，眼角部位皱纹面积降低了14.87%，有显著性差异。

图2 各时间点皮肤皱纹面积（P＜0.05）

从皮肤皱纹长度（见图3）来看，与使用样品前相比，31名受试者在使用样品14天后，眼底与眼角的皱纹长度分别降低了11.06%、13.91%，有显著性差异；使用样品28天后，眼底与眼角的皱纹长度分别降低了12.28%、16.07%，有显著性差异。

图3 各时间点皮肤皱纹长度（P＜0.05）

综上所述，STEE HILL溯华重组胶原蛋白紧致弹力套装在使用14d后有保湿效果，在使用28d后有抗皱效果。

4 结束语

基因工程技术的应用极大提高了胶原蛋白生产重组效率，使胶原蛋白能够实现稳定供应，继而使其在化妆品、医药、生物等领域中发挥实效。动物胶原蛋白具有不稳定性，且存在一定风险，故在当前胶原蛋白生产重组中，多以人胶原蛋白的动植物表达、微生物表达生产重组为主。结合案例重组胶原蛋白护肤品检测结果来看，该款护肤品在抗皱、保湿方面具有显著效果，而其功效的实现则是基因工程技术生产重组胶原蛋白的结果。