吴华鑫，赵野，王浩宇，张凤祥，邹刚，闫永庆

(东北农业大学园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

盐害是全球性的资源与生态问题，也是农业生产上最重要的逆境危害之一[1]。土壤中盐分的增加会引起土壤理化性质改变，间接导致植物受到伤害。植物在遭受盐害之后，生长发育受到影响，严重时萎蔫死亡[2]。盐胁迫的危害也表现在降低植物的发芽指数、发芽势，推迟萌发时间，从而导致种子发芽率降低；同时还影响植物对离子的吸收和转运，降低对钾(K)、氮(N)、磷(P)等营养素的吸收，而且植物在盐胁迫下吸收的离子相对单一，体内其他离子也会流失，从而导致营养失衡，使渗透调节等多方面紊乱[3]。植物为了应对盐胁迫形成了多种复杂的抵御机制，如积累渗透调节物质、离子区域化、形成大分子蛋白增加亲水性等[4]，除此之外，维护膜系统的完整性、内源激素和光合作用调节也能够抵御和缓解盐胁迫。

Ca2＋在植物为应对环境胁迫而形成的各种调节机制中发挥着重要作用，不仅是信号转导系统中的关键物质，还是植物生长发育必不可少的大量营养元素，缺少Ca2＋可使植物幼叶枯黄，根系发育迟缓，甚至枯死[5]。Ca2＋的存在可使细胞内维持胶体状态，中和细胞内代谢出的有机酸，维持细胞内的酸碱度在正常水平，从而保证内环境的稳定。Ca2＋浓度的降低或升高可以影响细胞壁的结构强度，调节细胞和组织的生长[6]。Ca2＋作为第二信使，能够根据不同的刺激信号产生特异性反应，通过作用于不同位置、不同时间进行特异性调控[7]；而Ca2＋结合蛋白通过对钙信号进行分析，引起细胞内发生抗逆反应，并直接或间接参与植物防御反应，调控下游蛋白，以响应环境胁迫。大量研究表明，外源Ca2＋可以提高植物的抗逆性，如施加外源Ca2＋能有效减轻干旱对结缕草的伤害[8]，提高盐胁迫下棉花的根冠比和有机物积累[9]，增加芒果的可溶性糖含量并降低在储存期间的发病率[10]，提高盐胁迫下草木樨叶片的气孔指数及维持细胞正常形态和功能[11]；适当浓度的外源Ca2＋可以提高水曲柳的光合作用电子传递效率、叶绿素含量、水分利用效率，从而缓解胁迫造成的伤害[12]。但外源Ca2＋的浓度并不是越高越好，当浓度过高时富余的Ca2＋能与磷酸盐在细胞内形成沉淀，使得植物的光合作用降低，生长速率减慢[13]。

西伯利亚白刺(Nitraria sibiricaPall.)为蒺蔾科白刺属(NitrariaL.)落叶具刺小灌木，大多分布于我国青海、甘肃等地，具有较强的耐盐能力，是治理土壤盐化的优良树种。其果实含有丰富的维生素，可直接食用亦可做成果脯、饮料；叶片可作为饲料，也可用于生产降血压和消炎的药物，具有一定的经济和药用价值。白刺根系发达，比地上部大4~22倍，其庞大的根系能够固定土壤和水分，长期生长的白刺周围土壤含盐量显著降低，因此常作为盐碱地绿化先锋树种使用，在盐碱地改良中发挥重要作用[14]。但目前有关外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺抗氧化酶活性以及内源激素含量影响的研究报道尚少。因此，本试验研究了在300 mmol∙L－1NaCl胁迫下浇灌15 mmol∙L－1CaCl2对西伯利亚白刺抗氧化生理特性和内源激素含量的影响，以探究外源Ca2＋缓解其盐胁迫伤害、提高抗盐性的机理，为应用外源Ca2＋提高白刺对盐胁迫的适应性提供理论基础，为今后盐碱区筛选和应用耐盐园林植物提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为西伯利亚白刺实生苗，种子由吉林省白城市林业科学研究院提供。播前将西伯利亚白刺种子先温水浸泡72 h，然后播于穴盘中，基质为按1∶1∶1(体积比)混合的纯净河沙、园土、草炭土；置于东北农业大学连栋温室内进行培养，自然光照，培养温度在17~28℃之间；待幼苗长出5~6片真叶时，定植到10 cm×10 cm的塑料花盆中，养护条件不变，待其长势良好，选取生长状态一致的白刺苗，根部用清水浸泡并冲洗干净后栽植到装有纯净河沙的花盆中，用1/2Hoagland全营养液浇灌缓苗，2周后进行相关试验处理。

1.2 试验设计

经预试验得知，300 mmol∙L－1是西伯利亚白刺耐受NaCl胁迫的阈值浓度，盐胁迫3 d时实生苗所受伤害较为明显，而15 mmol∙L－1CaCl2对盐胁迫的缓解作用最佳。在预试验的基础上，设计0、300 mmol∙L－1NaCl和0、15 mmol∙L－1CaCl2组合的4种处理:CK，空白对照，无NaCl、CaCl2处理；Ca2＋处 理，15 mmol∙L－1CaCl2；NaCl处 理，300 mmol∙L－1NaCl；NaCl＋Ca2＋处理，300 mmol∙L－1NaCl＋15 mmol∙L－1CaCl2。每盆种植3株西伯利亚白刺，每个处理10盆，共40盆。NaCl和CaCl2均按设计浓度对实生苗进行浇灌，为防止实生苗产生盐激反应，盐处理时从50 mmol∙L－1NaCl开始浇灌，逐天增加50 mmol∙L－1盐浓度，待达到预设浓度后，继续连续浇灌3 d，浇灌量大于基质持水量，便于多余盐分流出以保持盐浓度的稳定。处理结束一天后取样，将白刺叶片清洗干净后放入－80℃超低温冰箱保存备用。

1.3 测定指标及方法

叶片相对含水量的测定参照高俊凤[15]的方法；叶绿素含量的测定采用丙酮－乙醇混合法[15]；MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法[15]；SOD活性的测定采用氮蓝四唑显色法[15]；POD活性的测定采用愈创木酚法[16]；CAT活性的测定参考王学奎[16]的方法；内源激素(IAA、ABA、GA)含量采用酶联免疫(ELISA)试剂盒测定。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理与计算，利用GraphPad Prism 7.0软件处理数据并绘图，运用SPSS 20.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺叶片相对含水量及叶绿素和MDA含量的影响

由表1可见，与CK相比，Ca2＋处理对西伯利亚白刺叶片的相对含水量无显著影响，NaCl处理则显著降低叶片相对含水量20%；较NaCl处理，NaCl＋Ca2＋处理的叶片相对含水量明显增加，但仍低于CK，差异未达显著水平。总体来看，盐胁迫使西伯利亚白刺叶片的相对含水量显著下降，而增施外源Ca2＋能缓解盐胁迫伤害，使叶片相对含水量基本回升到正常水平。

正常生长状态下施加外源Ca2＋能增加西伯利亚白刺的叶绿素含量，但增幅较小，与CK差异不显著；NaCl处理下，叶绿素含量比CK下降了22%，差异显著；与NaCl处理相比，NaCl＋Ca2＋处理使西伯利亚白刺的叶绿素含量显著增加，但仍明显低于CK(表1)。表明外源Ca2＋的施加有利于NaCl胁迫下西伯利亚白刺的叶绿素生成。

NaCl处理下西伯利亚白刺叶片中的MDA含量显著高于其它处理，分别是CK、Ca2＋处理、NaCl＋Ca2＋处理的1.74、1.76、1.55倍；其余三处理间差异不显著(表1)。说明NaCl胁迫下西伯利亚白刺的膜脂过氧化反应剧烈，产生大量MDA，而外加Ca2＋能够有效降低NaCl胁迫的伤害，使MDA产量控制在对照水平。

表1 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺叶片 相对含水量、叶绿素和MDA含量的影响

2.2 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺叶片抗氧化酶活性的影响

2.2.1 SOD活性的变化 如图1所示，与CK相比，NaCl胁迫显著提高SOD活性，提高了67%；Ca2＋和NaCl＋Ca2＋处理的SOD活性进一步升高，两者间差异不显著，但显著高于CK和NaCl处理；与NaCl处理相比，NaCl＋Ca2＋处理的SOD活性显著提高0.3倍。表明，施加外源Ca2＋能提高盐胁迫下西伯利亚白刺叶片中的SOD活性，加速对超氧阴离子的歧化反应，从而提高其耐盐能力。

图1 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺叶片中SOD活性的影响

2.2.2 POD活性的变化 如图2所示，Ca2＋和NaCl处理的POD活性与CK相比无显著变化，但显著低于NaCl＋Ca2＋处理；NaCl＋Ca2＋处理比NaCl处理的POD活性增加了14%。表明NaCl胁迫下施加外源Ca2＋能有效增强西伯利亚白刺叶片内POD的活性，提高清除细胞内活性氧的能力，使光呼吸作用稳定进行，增强对盐胁迫的耐受能力。

图2 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺POD活性的影响

2.2.3 CAT活性的变化 如图3所示，与CK相比，NaCl、Ca2＋、NaCl＋Ca2＋处理的CAT活性均显著增高，分别是CK的1.50、1.90、1.87倍；NaCl＋Ca2＋处理的CAT活性比NaCl处理升高25%。可见施加外源Ca2＋能提高盐胁迫下西伯利亚白刺叶片内CAT的活性，从而提高其分解过氧化氢的能力，减弱盐胁迫造成的氧化伤害，提高植株的耐盐能力。

图3 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚 白刺CAT活性的影响

2.3 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚白刺叶片内源激素含量的影响

2.3.1 ABA含量的变化 ABA是一种应急胁迫激素，能够在不同逆境下调节植物的适应性。从图4可以看出，Ca2＋处理的ABA含量与CK基本一致；NaCl处理显著提高ABA含量，是对照组的1.65倍；NaCl＋Ca2＋处理的ABA含量显著高于CK，但显著低于NaCl处理20%。一般来说，ABA含量的增加与植物抗逆性的增强呈正相关，因此，施加外源Ca2＋能减弱NaCl胁迫对西伯利亚白刺的伤害，使其更能适应盐胁迫环境。

图4 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚 白刺ABA含量的影响

2.3.2 IAA含量的变化 由图5可知，NaCl处理的IAA含量显著低于CK、Ca2＋、NaCl＋Ca2＋处理，后三者间无明显差异。与NaCl处理相比，NaCl＋Ca2＋处理的IAA含量显著增加19%。可见，施加外源Ca2＋可使盐胁迫下西伯利亚白刺叶片中的IAA含量恢复到正常水平。

图5 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚 白刺IAA含量的影响

2.3.3 GA含量的变化 由图6可见，各处理下西伯利亚白刺的GA含量变化基本与IAA一致，也表现为与CK相比，NaCl处理显著降低GA含量(降幅为20%)，而Ca2＋和NaCl＋Ca2＋处理对其无明显影响；与NaCl处理相比，NaCl＋Ca2＋处理的GA含量显著升高24%。表明施加外源Ca2＋能将NaCl胁迫下西伯利亚白刺叶片内GA含量恢复到正常水平。

图6 外源Ca2＋对盐胁迫下西伯利亚 白刺GA含量的影响

3 讨论与结论

植物一切生理功能都与水有着极为密切的关系，叶片相对含水量是植物内部保水能力的最直接表现，关系着其生理功能能否正常进行[17]。本研究结果表明，在300 mmol∙L－1NaCl胁迫下，西伯利亚白刺叶片的相对含水量显著降低，与在蒙古黄芪幼苗上的研究结论一致[18]，说明土壤中含盐较高时，吸水困难，导致细胞产生失水现象[19，20]。叶绿素含量的多少能在一定程度上反映植株同化物质能力的强弱[21]。本研究中，西伯利亚白刺在盐胁下叶片叶绿素含量降低，说明植物遭受逆境胁迫时，叶绿体会被伤害，可能从叶绿素合成速度减缓而分解速率加快、相关合成酶活性减弱而分解酶活性增强两种途径减少叶绿素含量[22，23]。施加15 mmol∙L－1外源Ca2＋后，西伯利亚白刺叶片的相对含水量、叶绿素含量明显升高，说明Ca2＋可能通过调节气孔大小和光合作用来增加植物体内水分和叶绿素含量，从而提高植物抗性，这与Medvedev[24]的研究结论一致。

盐胁迫环境下，植物体内会产生大量的活性氧，MDA作为指示生物膜和酶损伤程度的重要指标，能够反映植物的抗氧化水平。本研究中，300 mmol∙L－1NaCl处理后西伯利亚白刺叶片中的MDA含量显著增加，说明膜系统受到明显伤害，这与刘会超等[25]在五叶地锦上的研究结果一致。植物抗氧化系统中的SOD、POD、CAT三种酶，在免除植物氧化损伤和清除体内活性氧中发挥着重要作用。本研究中SOD、CAT活性在300 mmol∙L－1NaCl胁迫下增加，分别比CK增加67%和50%，而POD活性无明显变化，这与范海霞等[26]在菊花上的研究结果不一致，可能是因为西伯利亚白刺为较典型的盐生植物，本身有着较强的耐盐能力，所以POD活性变化不是很明显。施加15 mmol∙L－1外源Ca2＋后，西伯利亚白刺叶片中的SOD、POD、CAT活性均有所提高，分别是NaCl胁迫下的1.30、1.14、1.25倍。

综上，Ca2＋除了能使植物膜结合蛋白保持稳定外，也在缓解盐胁迫中起着重要作用。正常情况下细胞内外的Ca2＋会维持在一个稳定平衡的状态，但当受到外界非生物胁迫时，胞外Ca2＋会内流，使胞内Ca2＋浓度升高，若内流持续时间较短则内流完成后会再次恢复到平衡状态，这是Ca2＋行使信号作用的基础[27]。而外源Ca2＋的增加相当于增加了信号的强度，可以引发一系列的生理生化反应，通过增加抗氧化酶活性加速清除胞内的活性氧，降低活性氧的积累，减弱膜脂过氧化的程度[28，29]，以维持细胞膜的结构和功能。

植物遭受盐害时也会通过改变体内激素含量调控不同的代谢活动，以使自身能维持正常的生命活动。本研究中，西伯利亚白刺在300 mmol∙L－1NaCl胁迫下，体内ABA含量显著增加，IAA、GA含量显著下降，这与罗玉婕等[30]在海棠上的研究结果一致。ABA可以调节气孔的开合度和蒸腾速率，受到盐胁迫时，ABA大量积累，可使气孔变小、蒸腾速率降低，从而减少体内水分流失[31]；在分子层面，它还可以通过诱导相关抗氧化酶基因、渗透调节相关基因和抗盐基因表达来增加渗透调节物质的含量，降低渗透势，从而减轻盐胁迫的伤害[32，33]。本研究中，与ABA在盐胁迫下含量增加不同，IAA、GA两种促进型激素在盐胁迫下含量减少，可能原因是Na＋和H＋通过Na＋/H＋逆向转运蛋白使得细胞内Na＋向外排出，H＋在细胞内的数量增加，IAA合成场所所需的正常pH环境受到干扰，使IAA含量下降[34]；GA能减小气孔阻力，提高蒸腾速率，受离子毒害作用更加明显，在盐胁迫环境下含量下降。施加外源Ca2＋后，ABA含量下降了20%，IAA和GA含量则分别增加了19%和24%，这与李青云等[35]的研究结果一致，可能是因为Ca2＋参与了激素对生理活动的调节，抑制了ABA的增长，促进了IAA、GA的生成。Li等[36]的研究表明ABA在诱导钙依赖蛋白酶(CDPK)的产生和对一些相关酶及基因的调控全部依赖于Ca2＋。

综上所述，300 mmol∙L－1NaCl胁迫对西伯利亚白刺的相对含水量、叶绿素和MDA含量、抗氧化酶活性、内源激素含量产生明显影响，施加15 mmol∙L－1外源Ca2＋可通过改变抗氧化酶活性和内源激素含量来减弱盐胁迫的伤害。但有关西伯利亚白刺耐盐机制的研究尚不完善，激素与Ca2＋的关系也需要进一步探明，今后可从调控Ca2＋的相关基因、Ca2＋的受体蛋白、Na＋的受体蛋白、渗透调节物质相关基因等方面进一步探索。