张梦琦李平波柳絮张华李臻刘芳姚方印

(1.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院湿地农业与生态研究所，山东 济南 250100)

水稻(Oryza sativaL.)是重要的粮食作物，其稳产和高产对保障世界粮食安全具有重要意义[1]。近年来，随着我国农业供给侧结构性改革的深入推进，土地流转速度的加快，作物生产急需向规模化、轻简化方向发展[2，3]。水稻旱直播是一种新型种植方式，与人工插秧和机械插秧相比，具有省工降本等优点，适用于水稻的规模化、轻简化种植。但是，旱直播方式的粗放田间管理导致杂草生长严重，对水稻的生长和产量影响很大[4]。因而，培育抗除草剂的水稻新品种是适应轻简化栽培的重要手段。

咪唑乙盐酸又称咪草烟，属于咪唑啉酮类除草剂，具有高效、广谱、低毒等特点，其作用机理是通过抑制高等植物体内乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)的活性从而抑制侧链氨基酸的合成[5]，进一步影响蛋白质的合成，有丝分裂指数下降，最终使组织失绿、黄化，植株逐渐死亡达到除草目的[6－8]。作物对咪唑啉酮类除草剂的抗性来源于ALS基因一个或多个氨基酸变异从而导致酶的结构变化，不同位点的突变产生了抗除草剂水平的差异[8－11]。王芳权等[12]在水稻品种资源材料中筛选到一株抗咪草烟的水稻(金粳818)，通过对其ALS基因的测序分析，发现其ALS基因第1 880位碱基G转换为A，即第627位氨基酸由丝氨酸(Ser，S)突变为天冬酰胺(Asn，N)。通过分子标记辅助选择，将金粳818来源的ALS基因导入其它水稻材料中，从而培育出抗咪草烟的水稻新品种，这对于水稻旱直播方式的推广具有重要意义[13，14]。

水稻的丰产和稳产受水稻鳞翅目害虫的影响。稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟可造成水稻减产5%~10%[15，16]。主要表现为叶片枯白、枯心苗、白穗等。对水稻鳞翅目害虫具有抗性的稻种资源目前尚未发现，因此对螟虫的防治主要以施用农药为主，但同时也存在农药残留污染、防治效果不佳以及增加成本等问题。培育抗虫水稻是抵御虫害的重要措施之一，目前，Bt毒蛋白基因是使用最广泛的抗虫基因，将Bt蛋白基因导入常规水稻，可以提高水稻对螟虫的抗性[17]。转基因抗虫水稻的种植推广对减少农药使用、增加作物产量、提高经济效益及环境保护等具有重要意义[18]。

本研究通过杂交和分子标记辅助选择育种技术，将抗除草剂ALS基因与抗虫基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A聚合，获得同时具有持久稳定的抗除草剂和抗虫的新品系，为黄淮稻区水稻直播和抗虫水稻的推广提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

显性核不育材料的除草剂抗性基因ALS来源于金粳818[12]。携带抗虫基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A的供体亲本华恢1号、T1C－19、T2A－1是由华中农业大学提供的单拷贝转Bt基因水稻株系。润农11、圣稻22、华粳5均是黄淮稻区的粳稻主栽品种，农艺性状优良。

1.2 分子标记检测

在水稻分蘖盛期取新鲜幼嫩叶片，采用CTAB法[15]提取供试水稻基因组总DNA。

利用王广达等[19]设计的一对特异性引物ALS－627－F/ALS－627－R和限制性内切酶DdeI对感咪草烟基因型(ALS－G)和抗咪草烟基因型(ALS－A)进行区分。利用Yang等[20]开发的引物Cry1Ab1Ac－F/Cry1Ab1Ac－R、Cry1C－F/Cry1CR、Cry2A－F/Cry2A－R对抗性基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A进行检测。具体引物序列见表1。

表1 本研究所用分子标记

1.2.1 抗虫基因的分子检测 PCR扩增体系(20 μL):DNA模板3μL，2×PowerTaqPCR Master-Mix 10μL，正反引物各0.5μL，ddH2O 6μL。PCR扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经4%琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色后在紫外透射仪下观察。

1.2.2 抗除草剂基因ALS的分子检测 PCR扩增体系及程序同1.2.1。酶切体系(30μL):DNA模板(PCR扩增产物)20μL，10×K Buffer 3μL，DdeⅠ酶0.34μL，ddH2O 6.66μL。37℃反应0.5 h。经4%琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色后在紫外透射仪下观察。

1.3 性状评价

1.3.1 田间除草剂抗性鉴定 于苗期人工喷洒咪唑乙盐酸除草剂在水稻植株叶片上，5 d后进行观察。

1.3.2 田间抗虫鉴定 在不用任何药剂防治的情况下，于每年稻纵卷叶螟高发期，田间调查其危害情况及引起的白穗发生情况，并统计白穗率。

1.3.3 双抗材料的农艺性状 聚合Cry1Ab/Ac和ALS、Cry1C和ALS、Cry2A和ALS基因的双抗水稻新品系按小区种植，小区面积5 m2。同时种植华恢1号、T1C－19、T2A－1、润农11、圣稻22、华粳5作为对照。所有供试水稻材料均种植于山东省农业科学院饮马泉试验基地，5月4日播种，6月4日插秧，正常大田管理。农艺性状调查分为抽穗期、株高、每穗实粒数、千粒重和穗长，具体方法参考«水稻种质资源描述规范和数据标准»[21]。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Office Excel 2007进行数据处理。不同材料均值的多重比较利用R软件包multcomp和Tukey测验进行分析。图片采用PowerPoint 2007绘制，后期采用Adobe Photoshop CS5进行加工。

2 结果与分析

2.1 双抗水稻新品系选育过程

以聚合ALS和Cry1Ab/Ac的双抗水稻新品系选育为例，具体选育过程如图1所示。以携带纯合基因ALS的粳型显性核不育系为起点，通过和携带纯合基因Cry1Ab/Ac的籼稻华恢1号杂交一次，引入抗虫基因。杂交后代的F1单株均携带了杂合的ALS和Cry1Ab/Ac基因以及50%粳稻遗传背景，且可育单株和不育单株以1∶1的比例分离；以不育的F1单株为母本，以黄淮区的主栽粳稻品种A(润农11)为父本杂交一次，提升后代单株的粳稻遗传背景至约75%。在杂交后代FA1群体中，基因ALS和Cry1Ab/Ac发生了分离；通过分子标记辅助选择，挑选携带两个基因的阳性不育单株为母本，以黄淮区主栽粳稻品种B(圣稻22)为父本杂交一次，提升后代单株的粳稻遗传背景至约87.5%。继续挑选携带两个基因的阳性不育FB1单株为母本，以黄淮区主栽粳稻品种C(华粳5)为父本杂交一次，提升后代单株的粳稻遗传背景至约93.75%。在杂交后代FC1群体中，挑选两个基因阳性且农艺性状优良的可育单株，连续自交至F6世代；在连续自交的过程中，每个世代均进行两个基因的选择和农艺性状选择。最终，在F6世代单株中，挑选两个目标基因纯合、农艺性状优良的单株作为携带ALS和Cry1Ab/Ac的双抗水稻新品系。

图1 携带ALS和Cry1Ab/Ac双抗水稻新品系的选育过程示意图

根据上述选育过程，最终得到聚合Cry1Ab/Ac与ALS基因的水稻品系2个:1A1、1A2；聚合Cry1C与ALS的水稻品系2个:1C1、1C2；聚合Cry2A与ALS的水稻品系2个:2A1、2A2(图2)。

图2 基因ALS(A)、Cry1Ab/Ac(B)、Cry1C(C)、Cry2A(D)的分子标记检测

2.2 双抗水稻新品系的抗除草剂评价

在喷施除草剂后，水稻生长缓慢，叶色加深。1周后不含抗除草剂ALS等位基因的水稻开始出现凋萎和死亡，先从新叶枯死，随后老叶也逐渐枯死，15 d后基本全部死亡；而抗除草剂水稻开始恢复并正常生长(图3)。

图3 田间抗除草剂鉴定

2.3 双抗水稻新品系的抗虫性

由表2可知，双抗新品系的白穗率介于0.20%~0.50%之间，远远低于3个主栽品种(约39%)，与3个抗虫亲本的白穗率(约0.20%)相当，表明新品系的抗虫性得到明显提高。

表2 亲本与双抗株系稻纵卷叶螟危害情况

2.4 双抗水稻新品系的农艺性状评价

由表3可知，在抽穗期方面，聚合Cry1Ab/Ac和ALS基因的新品系1A1和1A2与主栽品种圣稻22一致，聚合Cry2A和ALS基因的新品系2A1和2A2与主栽品种华粳5一致，聚合Cry1C和ALS基因的新品系1C1和1C2比主栽品种圣稻22长约2 d。在株高方面，新品系1A1和1A2、2A1和2A2分别与主栽品种华粳5和圣稻22一致，而新品系1C1和1C2比主栽品种圣稻22高约2 cm。在每穗实粒数方面，6个新品系均显著低于3个主栽品种。在千粒重方面，新品系1A1、1C2和2A1显著低于3个主栽品种，新品系1C1和2A2与主栽品种润农11一致，新品系1A2介于主栽品种华粳5和润农11之间。在穗长方面，新品系1A2、1C2和2A1与主栽品种圣稻22相差不大，新品系1C1介于主栽品种润农11和圣稻22之间。基于5个性状的综合考量，6个新品系的农艺性状表现均接近于主栽品种。

表3 润农11、圣稻22、华粳5及6个双抗新品系主要农艺性状

3 讨论与结论

近年来，水稻由播种、插秧的传统方式逐步向直播等轻简栽培方式转变。在直播稻田中容易发生杂草，危害农作物生长，尤其是与直播相伴的杂草危害已经严重影响了水稻的产量和品质[22，23]。本研究将抗除草剂品种金粳818来源的ALS等位基因应用于双抗水稻新品系的选育，相比于目前的主栽品种润农11、圣稻22和华粳5，新品系对除草剂咪唑乙盐酸表现出很好的抗性。该结果为ALS等位基因在抗除草剂品种的培育过程中的应用提供了重要的理论支持，并进一步证实了该基因的广阔应用前景。

利用Bt基因能够增强植物对螟虫的抗性，已经在国内外多年的研究和商业化种植中得到了充分证明[24－26]。本研究将转基因籼稻材料携带的3个抗虫基因引入黄淮稻区的粳稻育种群体中，Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A基因及其介导的抗性在所有杂交和自交获得的转基因株系中均能稳定遗传和表达，并表现出很强的抗虫能力。该结果为抗螟虫粳稻的培育提供了理论基础。

本研究利用分子标记辅助选择和传统育种相结合的方法，将抗除草剂基因ALS和3个抗虫基因导入粳稻，并选育出6个农艺性状优良的水稻新品系。相比于目前黄淮稻区的主栽品种，6个水稻新品系在保证产量的前提下，显著提高了除草剂抗性和螟虫抗性，为黄淮稻区水稻的直播和绿色种植提供了重要的材料基础。