张翠, 孙一丁, 马继琼 , 杨奕, 郭怡卿, 李进斌, 许明辉,*

稻瘟病抗性对根际土壤微生物多样性的影响

张翠1,2, 孙一丁1,3, 马继琼1,3, 杨奕1,3, 郭怡卿2, 李进斌4, 许明辉1,3,*

1. 云南省农业生物技术重点实验室, 农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室, 昆明 6502052. 云南农业大学植保学院, 昆明 6502013. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 昆明 650205 4. 云南省农业科学院农业环境资源研究所, 昆明 650205

为了解稻瘟病抗性与根际土壤微生物之间的关系, 在云南宜良大田条件下对6个稻瘟病单基因系、和受体“丽江新团黑谷”()进行了诱发鉴定, 利用ITS1和16S rDNA高通量测序技术对土壤根际真菌的ITS1序列以及细菌16S rDNA区片段进行了分析。结果显示单基因系表现抗病,和表现感病; 子囊菌门(Ascomycota)是真菌的优势门(73.41%), 变形菌门(Proteobacteria)是细菌的优势门(32.48%), 7个土样在主要微生物种类组成上相似; 抗、感单基因系根际土壤真菌在罗兹菌门(Rozellomycota)(分别为7.69%和14.66%, LTH为5.59%)及其下属的罗兹菌种(sp)(分别为6.97%和13.99%, LTH为5.59%)和担子菌门(Basidiomycota)的伞菌纲(Agaricomycetes)(分别为1.2%和0.7%, LTH为1.7%)及伞菌目(Agaricale)(分别为1.1%和0.5%, LTH为1.6%)上存在显著性差异(<0.05); 细菌在变形菌门(Proteobacteria)的-变形菌纲未鉴定的目上存在显著性差异<0.05), 相对平均丰度分别为10.02%和11.65%, 受体LTH为8.55%, 表明水稻抗性对根际土壤微生物丰度有影响。结果为探究稻瘟病的抗病机理和生物防治提供了线索。

稻瘟病; 单基因系; 土壤真菌; 土壤细菌; ITS1; 16S rDNA

0 前言

稻瘟病是世界性水稻病害, 是造成水稻减产的重要因素之一[1]。长期以来过度施用农药防治稻瘟病给环境和人类健康造成了严重威胁[2], 生物防治控制植物病害越来越成为人们研究的重点。近年来的研究结果显示细菌中对稻瘟病具有生物防治潜力的有芽孢杆菌属、假单胞属、肠杆菌属、葡萄球菌、欧文式菌等[3]。随后, 从水稻茬和水稻根系土壤中分离到假单胞杆菌JD-2和DW22号, 其内生真菌次生代谢物会对稻瘟病病原菌产生拮抗作用[4-5]。利用从土壤DNA宏基因组文库中筛选出与防治稻瘟病相关的新基因DNA-directed RNA polymerase、SocE等生产绿色生物农药, 能增加粮食产量和减少环境污染[6]。由此证明, 探究稻瘟病抗性与水稻根际土壤微生物多样性之间的关系对完善稻瘟病的生物防治、增加水稻产量、减少环境污染具有重要意义。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 能有效降解污染物, 促进土壤有机质和土壤养分(N、P、S等)的转化和循环[7]。土壤微生物的群落结构和多样性受土壤理化性质, 农田耕作措施, 种植类型, 作物基因型和化感作用等因素影响[8-12]。水稻连作导致作物根系分泌物、残根和凋零物的质、量发生显著变化, 从而影响根际土壤微生物多样性[13-14]。紫色土、砂姜土、黑土和红壤四种水稻土中微生物群落多样性的分析表明, 紫色土中微生物种群最丰富, 其生物固氮活性高于其他三种土[15]。水稻条斑病抗性品种之间的根际微生物的多样性存在着差异, 即抗病品种的根际微生物的多样性较感病品种更丰富[16]。化感水稻根系通过化感作用向土壤分泌酚酸类、萜类、固醇类等化感物质影响微生物群落多样性, 从而影响临近植物的生长[17]。因此, 水稻根际土壤微生物的多样性是研究水稻与土壤微生物之间关系的重要内容之一。

单基因系遗传背景一致, 携带基因明确, 被广泛应用于作物的遗传育种研究中[18], 国际水稻研究所与日本合作以普通感病品种“丽江新团黑谷”为遗传背景育成的24个水稻抗稻瘟病单基因系, 目前已被有效用于稻瘟病抗性基因筛选, 稻瘟病生理小种鉴别, 水稻基因功能和基因遗传互作, 水稻生理特性与环境之间的关系等方面[19-21]。基于此，拟用6个单基因系和受体品种“丽江新团黑谷”()为材料对根际微生物群落结构、相对丰度等进行分析, 探究抗、感单基因系与根际土样微生物多样性的关联, 明确抗感单基因系与其根际微生物多样性之间是否存在相互影响, 对稻瘟病抗性与土壤微生物相互作用机制研究、促进稻瘟病的生物防治、稻瘟病抗性品种选育具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料及土样采集

6个水稻单基因系和感病对照品种“丽江新团黑谷”种植于云南省宜良县(海拔1600 m, 24.92°N), 同一田块, 确保每个单基因系的实验条件相同。每个系1个小区, 小区面积为20平方米(4 m×5 m)。小区周围种植诱发品种“蒙古稻”自然诱发稻瘟病, 不施用杀菌剂, 通过重施氮肥(尿素525 kg.ha-1)、密集种植(行距20 cm, 植株间距10 cm)。

水稻移栽之前, 用5点采样法从试验田采集混合土样, 土样在云南省农业科学院质量标准与测试技术研究所的检测结果表现为较为肥沃, 其基本特征如下: 有机质(23.31 g.kg-1), 碱性氮(85.31 g.kg-1), 速效磷(89.13 g.kg-1), 速效钾盐(46.21 mg.kg-1)、pH(7.35)。水稻孕穗期放干水再采土样。每个单基因系试验小区中, 离表层约10 cm处带土取5个水稻植株, 弃除植株周围土壤, 保留根系周围5 cm土壤, 将5个水稻植株土样平均混合。立即冷藏, 送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA提取、测序和数据分析。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增

使用E.Z.N.A. ® soil DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美国) 土壤DNA提取试剂盒提取7个土样微生物群落基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶检测DNA质量。在ABI Gene Amp®9700 PCR仪上, 利用引物ITS1-F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3’)和 ITS1-R(5’-TGCGTTCTTCATCGATGC- 3’), 扩增真菌ITS 1序列, 利用引物 341F(CCTACG GGAGGCAGCAG)和518R(ATTACCGCGGCTGCT GG)扩增细菌16S rDNA 序列。PCR扩增程序: 95 ℃变性5 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 35个循环。72 ℃延伸5 min, 4 ℃结束延伸。 PCR混合物包含5×Trans Start Fast Pfu缓冲液2 μL, 2.5 mM dNTPs 1 μL, 正向引物(5 μM)1 μL, 反向引物(5 μM)1 μL, Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶0.3 μL, 模板DNA (10 ng)1 μL, 最后ddH2O补至20 μL。

1.2.2 真菌ITS1和细菌16S rDNA测序

利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen­Biosciences, Union City, CA, USA)分别回收2 %琼脂糖凝胶检测过的6个单基因系和LTH的PCR产物, 并用Quantus™ Fluorometer (Promega, USA) 检测回收产物定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行测序、链接、建库。

1.2.3 数据的处理分析

使用UPARSE(7.1版, http: //drive5.com/uparse/)对97%相似性非重复序列进行OUT(Operational Taxonomic Units)聚类, 通过鉴定去除嵌合序列。使用0.7的置信度阈值, RDP分类器(http://rdp.cme. msu.edu/), 在数据库UNITE(version 8.0)中对每个OTU(Operational taxonomic units)代表序列进行查询分类。显著性测试使用上海吉美生物有限公司(https://cloud.majorbio.com/report/species_difference_two_group/task_id/)的云端进行在线分析, 基于样本中群落丰度数据, 运用严格的统计学方法检测抗性单基因系和感病单基因系组间微生物群落中表现出的丰度差异的物种, 进行假设性检验, 评估观察到的差异的显著性。微生物Alpha 多样性指标包括ACE 指数、Chao1 指数、香农-威纳指数( Shannon- Wiener index) 、丰富度指数( richness) 、均匀度和覆盖度等, 各指数的计算方法参见邵宗圆等人的方法[22]。

单基因系抗性表现按《中华人民共和国国家标准 GB/T15790—2009》品种抗性划分标准(叶瘟抗性分级指标) 于蜡熟期调查穗颈稻瘟发病情况, 调查按《中华人民共和国国家标准 GB/T15790—2009》品种抗性划分标准(穗颈瘟抗性分级标准)进行调查。

2 结果与分析

2.1 单基因系稻瘟病抗性表现

本课题组连续2年在宜良试验点种植6个抗稻瘟病单基因系、感病对照品种“丽江新团黑谷”和诱发品种“蒙古稻”。其中诱发品种“蒙古稻”叶瘟达到高感1 级以上, 穗颈瘟达到感病级, 感病对照“丽江新团黑谷”叶瘟和穗颈瘟均分别达到感病 1 级和感病级以上, 表明大田自然诱发成功。稻瘟病抗性表现鉴定结果表明单基因系Piz、Pib、Pikh对稻瘟病表现抗病, Pi19、Pi3、Pita和LTH表现感病(表1)。

2.2 6个单基因系根际真菌多样性与差异分析

2.2.1 6个单基因系根际真菌种类组成

7个土样测序覆盖率超过 99.95%, 表明测序足够深, 满足后续数据分析。通过过滤、拼接等步骤, 从7个土壤样品中获得了498239有效片段(clean reads), 以97%的相似度聚为2723分类操作单位OTU, 平均长度为389 bp 。其中有很大一部分OTU丰度小, 仅在部分样品中出现, 每个样本只能检测到其中一部分OTU, 范围从321到430个(表2 Sob指数)。样品间Shannon指数数值差异小, Simpson (1-D)指数非常低, 小于5%(表2), 结果表明7个土样间多样性并不存在显著的差异。物种注释显示, 在7个土壤样品中检测到12个门和1个未分类的菌群, 35个纲(包含7个未分类的菌群), 72个目(包含14个未分类的菌群), 141个科(包含31个未分类的菌群), 236个属(包含56个未分类的菌群)和348个种(包含105个未分类的菌群)。可见, 试验地土壤真菌种类较为丰富。

表1 单基因系稻瘟病抗性表现

表2 真菌群落多样性指数

在检测到的12个门和1个未分类真菌群中(图1), 其中子囊菌门(Ascomycota)在7个土样中均为优势门, 相对丰度分别是73.41%、54.13%、60.56%、46.84%、64.46%、67.55%、73.52%, 罗兹菌门(Rozellomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、梳霉门(Kickxellomycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、捕虫霉门(Zoopa­gomycota)、Basidiobolomycota芽枝霉门(Blasto­cladiomycota)、单毛壶菌门(Monoblepharomycota)的平均相对丰度分别为10.45%、6.49%、1.94%、1.01%、0.71%、0.58%、0.27%、0.12%、0.04%、0.02%、0.02%。未分类的真菌(p_unclassified_k_Fungi)平均相对丰度为14.41%, 占比较大。芽枝霉门、单毛壶菌门、Basidiobolomycota球囊菌门并未在所有样品中检测到, 只在2—6个样品中出现, 且它们相对丰度较低。可见, 门水平上6个单基因系和根际主要真菌门结构组成相似。

2.2.2 抗感单基因系根际真菌差异分析

经过显著性检验, 抗、感单基因系间根际土壤真菌在某些菌群上存在显著的差异。在门(罗兹菌门p_Rozellomycota)、纲(罗兹菌门未分类纲c_uncla­ssified_p_Rozellomycota和伞菌纲c_Agarico­mycetes)、目(罗兹菌门未分类目o_unclassified_p_ Rozellomycota和伞菌目o_Agaricales)、科(罗兹菌门未分类科f_unclassified_p_Rozellomycota), 属(罗兹菌门未分类属)、种(罗兹菌种sp)各水平上均有菌群存在显著性差异(<0.05)(表3)。

在门水平上, 罗兹菌门(p_Rozellomycota)在抗、感单基因系中的平均相对丰度分别为7.69%和14.66%, LTH的相对丰度为6.09%(表3, 图2A); 种水平上, 罗兹菌种(sp)在抗、感单基因系中的平均相对丰度分别为6.97%和13.99%, LTH的相对丰度为5.59%(表3, 图2F)。

图1 门水平上6个稻瘟病抗感单基因系土样真菌群落构成

Figure 1 The rhizosphere soil fungi community composition of six monogenic rice lines to blast resistant at phylum level

在纲水平上, 担子菌门(Basidiomycota)的伞菌纲(Agaricomycetes)在抗、感单基因系中的平均相对丰度分别为1.2%和0.7%, LTH的相对丰度为1.7%(表3, 图2G); 目水平上(平均相对丰度小于1%), 伞菌纲(Agaricomycetes)的伞菌目(Agari­cales)在抗、感单基因系中的平均相对丰度分别为1.1%和0.5%, LTH的相对丰度为1.6%(表3, 图2H)。结果表明抗、感单基因系对根际土壤的真菌丰度有一定影响, 稻瘟病抗性与根际土壤真菌多样性相关。

2.3 抗感单基因系根际细菌多样性与差异分析

2.3.1 抗感单基因系根际细菌种类组成

7个土样测序覆盖率超过 96.95%, 测序深度可以满足后续分析。通过过滤和拼接等步骤, 从7个土壤样品中获得了323214个有效片段(Clean Reads), 以97%的相似度聚为28565分类操作单位OTU, 平均长度为4080 bp 。其中部分OTU丰度小, 仅在部分样品中出现, 每个样本只能检测到其中一部分OTU, 范围从3924到4170个(表4指数)。样品间Shannon指数数值差异小, Simpson(1-D)指数非常低, 小于3%(表4), 表明样品间多样性并不存在较大的差异, 但根际细菌群落是多样的。物种注释显示, 在7个土壤样品中检测到46个门(包含1个未分类菌群), 124个纲(包含9个未分类的菌群), 336个目(包含25个未分类的菌群), 558个科(包含53个未分类的菌群), 1016个属(包含114个分类地位未定或未分类的菌群)和2173个种(包含621个分类地位种)。可见, 试验地土壤细菌种类较为丰富。

表3 单基因系根际土壤真菌差异显著菌群及平均数比较

注: *<0.05差异显著。

Figure 2 Analysis of soil fungi of monogenic lines with differences

表4 细菌群落多样性指数

7个土样中检测到相对丰度大于1%的有12个门, 变形菌门(Proteobacteria)是根际土样细菌的优势门, 相对丰度分别32.48%、26.75%、33.55%、35.39%、34.83%、40.80%、32.81%。绿弯菌门(Chloroflexi)、乳酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、(Latescibacteria)、(Rokubacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、(Patescibacteria)、浮霉菌门(Plancto­mycetes)的平均相对丰度分别为16.23%、14.90 %、 6.94%、6.62%、5.50% 、3.18%、2.00%、1.76%、1.76%、1.41% 、1.07% 。其他(Other)相对丰度小于1%的细菌总量的平均相对丰度为4.80%, 占比相对较小。门水平上, 7个根际土样中细菌群落结构组成也是相似的(图3)。

2.3.2 抗感单基因系根际细菌差异分析

经显著性差异分析, 抗、感单基因系根际土壤细菌(相对丰度大于1%)在门、纲、科、属、种间差异性均不显著, 仅在目水平上, 变形菌门(Proteoba­cteria)γ-变形菌纲(c_Gammaproteobacteria)的Beta­proteobacteriales目上存在显著差异(图4)(<0.05), 其相对平均丰度分别为10.02%, 11.65%, LTH相对丰度为8.55%。可见抗、感单基因系对其根际土样的细菌丰度可能存在影响, 稻瘟病抗性与根际土壤细菌多样性相关。

3 讨论

水稻根际土壤微生物多样性的影响因素很多, 其中土质、耕作方式、施肥、农药等环境因素影响显著[23-26], 此外作物不同的基因型甚至同一基因型的不同发育阶段均会影响土壤微生物的多样性[27]。王晓洁等研究表明变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和蓝藻门(Cyanobacteria)是水稻土红壤、黑土、紫色土、下位砂姜土细菌群落优势类群。其结构差异显著。红壤中细菌丰度最高, 群落多样性最低。紫色土因具有潜在的生物固氮优势类群细鞘丝藻属(Leptolyngbya)而具有最高的土壤生物固氮速率, 四种类型水稻土细菌群落结构的主要因子是土壤pH、有机碳和碱解氮含量[15]。张慧等研究表明不同种植模式容易影响微生物的多样性, 冬季作物的根际分泌物导致土壤中微生物的数量和种类发生变化; 种植不同的冬季作物在土壤中残留的作物残骸不同, 从而导致水稻发育过程中土壤的有机质成分有所不同, 影响了不同种植模式下稻田土壤的微生物多样性。因此, 选用适当的种植模式能有效地改善土壤肥力、土壤微生物的活性以及有益微生物所占比例[25]。张仕颖等研究表明丁草胺的施用会改变水稻土微生物群落代谢活性, 中、低浓度促进微生物生长, 高浓度抑制其生长, 丁草胺对水稻土壤微生物的促进和抑制作用随着时间的延长而逐渐减缓, 最后完全消失。此外, 丁草胺还会影响水稻土微生物群落碳源利用能力 , 施药浓度直接导致微生物群落碳源利用能力集中、可利用碳源种类数减少。丁草胺对土微生物群落碳源利用能力的影响会随着它的自然降解逐渐消退[26]。杨俊等对水稻条斑病抗感品种根际微生物群落结构和功能分析结果表明不同的抗性基因增加或抑制了水稻根际土壤微生物的数量, 条斑病抗性品种CG2的碳源(碳水化合物、氨基酸类、酯类、醇类、胺类和酸类)的利用率比感病品种IR24的高, 抗病品种的多样性和感病品种相比均有增加[16]。而文中抗性单基因系与感病单基因系根际土壤微生物群落丰度之间并未呈现出显著的规律性差异。由于实验材料遗传背景一致, 仅基因型及抗性之间存在差异, 导致这一结果的原因可能是不同植物的不同基因型影响根际土壤微生物的氮源利用率, 其值越大, 微生物群落代谢活性越高, 微生物越丰富[27], 植物对土壤微生物的调节作用, 植物通过分泌有机物磷脂脂肪酸等对其根际土壤微生物起到正向调节[28]; 植物激素合成和信号传导影响了稻瘟病的抗性从而影响了根际微生物群落的多样性。林丹等通过对独脚金内脂这种植物激素的生物合成和信号传导在调控水稻根际微生物和应对稻瘟病菌抗性机理的研究结果表明独脚金内酯的生物合成和信号传导可增强水稻对稻瘟病的抗性, 直接或间接的参与不同代谢途径从而对根际土壤微生物群落结构产生影响[29-30]。

图3 门水平上6个稻瘟病抗性单基因系土样细菌群落构成

Figure 3 The rhizosphere soil bacterial community composition of six monogenetic rice lines to blast resistant at phylum level

图4 细菌显著性差异分析

Figure 4 Analysis of bacteria significant differences

4 结论

文中对以“丽江新团黑谷”为受体的6个稻瘟病抗性单基因系根际土样进行高通量测序, 分析稻瘟病抗性与根际土壤微生物多样性之间的关系, 结果显示, 平均相对丰度大于1%且差异显著(<0.05)的罗兹菌(Rozellomycota)、变形菌(Proteo­bacteria), 其感病单基因系的平均相对丰度高于抗性单基因系, 而差异显著的担子菌门() 的伞菌纲(Agaricomycetes)及伞菌目(Agaricales)(平均相对丰度小于1%)的结果刚好相反, 表明稻瘟病的抗性与其土壤微生物群落结构多样性相关, 表现感病的受体品种“丽江新团黑谷”LTH在罗兹菌门和变形菌中的相对丰度低于抗、感单基因系在担子菌门的伞菌纲及伞菌目中的相对丰度高于抗、感单基因系, 目前的研究暂时还无法解释这一现象, 有待进一步的探索。

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Effect of rice blast resistance on microbial diversity in rhizosphere soil

ZHANG Cui1,2*, SUN Yiding1,3, MA Jiqiong1,3, Yang Yi1,3, Guo Yiqing2, Li Jinbin4, Xu Minghui1,3,*

1. Key Laboratory of Biotechnology Research of Yunnan Province, Key Laboratory of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture, Kunming 650205, China 2. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 3. Institute of Biotechnology and Genetic Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China 4. Institute of Agricultural Environment and Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China

To understand the relationship between the rhizosphere microbes and resistance to rice blast, six monogenic lines include genes,,,,,to rice blast and receptor "Lijiangxintuanheigu" () were cultivated in Yiliang of Yunnan Province and were induced by appraisal . ITS1 sequence of soil rhizosphere fungi and V3-V4 sequence in 16S rDNA of bacteria were sequenced by using high throughput sequencing technology.The results showed that the monogenic lines,andshowed resistance to blast, but,,andshowed susceptibility. Microbial species query analysis suggest that Ascomycota was the dominant phylum of fungi (73.41%), Proteobacteriawas the dominant phylum of bacteria (32.48%), and 7 soil samples were similar in composition of main microbial groups. The relative abundance with significant differences in Rozellomycota(7.69% and 14.66%, LTH5.59%),sp(6.97% and 13.99%, LTH5.59%), Agaricomycetes(1.2% and 0.7%, LTH1.7%)and Agaricale(1.1% and 0.5%, LTH1.6%) between resistant and susceptible monogenic lines rhizosphere soil fungi (<0.05). The relative abundance of Proteobacteriaproteobacteriabelongs to bacterial was 10.02% and 11.65% and the receptorwas 8.55%, indicated that rice resistance had an influence on the abundance of rhizosphere soil microbial. The results of this study provide a clue to explore the mechanism of disease resistance and biological control of rice blast.

rice blast; monogenic lines; soil fungi; soil bacterial; ITS1;16S rDNA

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.06.016

X172

A

1008-8873(2022)06-130-09

2020-10-28;

2020-12-31

国家自然科学基金项目(31860369)

张翠(1995—), 女, 云南曲靖人, 硕士研究生, 主要从事水稻抗(耐)稗草机理研究, E-mail:1942669465@qq.com

通信作者:许明辉, 男, 研究员, 主要从事稻瘟病抗性育种研究, E-mail:ynxuminghui@163.com

张翠, 孙一丁, 马继琼, 等. 稻瘟病抗性对根际土壤微生物多样性的影响[J]. 生态科学, 2022, 41(6): 130–138.

ZHANG Cui, SUN Yiding, MA Jiqiong, et al. Effect of rice blast resistance on microbial diversity in rhizosphere soil[J]. Ecological Science, 2022, 41(6): 130–138.