陈秀程, 王江勇, 孙敬锋

盐度对哈维弧菌耐药性的影响及耐药基因的表达实验研究

陈秀程1, 2, 王江勇1,*, 孙敬锋2

1. 惠州学院, 惠州 516007 2. 天津农学院, 天津 300384

为研究不同盐度对哈维弧菌生理生化和耐药性的影响, 探讨不同盐度对哈维弧菌的耐药表型与携带耐药基因的变化, 以哈维弧菌9H7R为主要研究对象, 在盐度为 5、10、15、20、25 ppt下, 采用纸片扩散法(Kirby-Bauer纸片扩散法, 简称K-B法), 参照NCCLS抗生素敏感试验操作标准, 研究哈维弧菌在不同盐度下耐药性的变化。然后提取细菌 RNA、经反转录及 qPCR,再根据特定基因计算相对表达量。结果显示: 不同盐度生长的哈维弧菌, 对喹诺酮类药物的耐药性发生了变化, 且耐药基因的表达量受到了影响。

哈维弧菌; 盐度; 抗生素; 耐药性; 荧光定量PCR

0 前言

哈维弧菌()是水产养殖动物重要的条件致病菌, 广泛存在于海洋环境中, 主要是存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中, 在25 ℃—37 ℃的温度范围快速繁殖, 具有嗜盐性, 在盐度较高水域存活[1]。高密度生长哈维弧菌时会呈现发光现象, 可同时感染多种水生动物, 可引起杂色鲍()肌肉萎缩症[2], 感染对虾“发光弧菌病”、大黄鱼弧菌病等, 感染哈维弧菌病, 病鱼呈现眼球突出、肌肉溃烂、内脏坏死等症状并导致其死亡, 对海水养殖业造成巨大的损失。哈维弧菌作为病原菌具有致病性强、传播速度快、流行范围广、死亡率高等特点。目前对哈维弧菌病的防治主要是采用抗菌药物(如复方新诺明和喹诺酮类药物等)。抗生素是指能够杀死病原菌或抑制其生长, 对人体或动物本身没有毒性的一类药物。随着抗生素在养殖动物中的大量应用, 哈维弧菌对抗生素的耐药性日益严重, 吴立婷等[3]从病死的大黄鱼中, 分离并鉴定出 54 株哈维弧菌, 药敏结果表明对复方新诺明和阿莫西林等的敏感范围显示耐药, 对 13 种抗生素产生高耐药性, 耐药菌株占总菌株量的37%。Stalin等[4]从印度孟加拉湾东海岸的黑虎虾塘和海岸的水体悬浮沉积物样品中分离并鉴定出5株哈维弧菌, 其中3株来自各类虾塘, 2株来自沿海地区进行了15种抗生素的分析,结果显示与其他检测抗生素相比, 哈维弧菌对环丙沙星、青霉素、利福平和万古霉素具有耐药性。已有的报道表明在贝类中弧菌的污染率较高[5], 多种疾病通常是由弧菌属病原菌引起的[6]。然而抗生素的大量使用导致海水养殖源弧菌产生严重的耐药性。王瑞旋等分离鉴定了来自海南鲍鱼足脓肿病的哈维弧菌, 报道哈维弧菌对卡那霉素和克林霉素有耐药性[7]。Kang等[8]从韩国西海以及贝类养殖场附近收集的海水中分离并鉴定出哈维弧菌, 840份海水样品中分离出2株哈维弧菌, 选定16种抗生素进行了分析, 发现它们对头孢霉素、万古霉素、氨苄西林、头孢吡肟、头孢替坦和链霉素具有耐药性；Stalin等研究印度东南沿海对虾养殖环境中的哈维弧菌耐药性得出, 全部菌株对氨苄青霉素、头孢克洛、庆大霉素、诺氟沙星耐药[9]。其中喹诺酮类药物在水产养殖业中应用广泛, 水产养殖环境中的细菌对此类药物的耐药性日趋显著。哈维弧菌在无盐培养基中不生长, 在含盐营养琼脂平板上生长良好, 28 ℃培养 24 h 可以形成圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、闪光的菌落, 在TCBS 平板上为黄色菌落, 4 ℃以下和 40 ℃以上不能生长[10], pH值在5.0—7.9都可以正常生长。由于哈维弧菌的嗜盐性, 在高盐度下, 哈维弧菌生长数量增加, 抗生素用量增大会使耐药性发生改变, 不同抗生素的使用也会影响细菌耐药性的改变[11]。不同细菌之间会发生耐药性的传递, 会导致耐药性的改变, 且来源不同环境下的哈维弧菌耐药性不同[12]。

本研究针对不同盐度下的哈维弧菌进行耐药分析, 采用Kirby-Bauer纸片扩散法(简称K-B 法)和特定耐药基因的检测(qPCR: 实时荧光定量PCR), 模拟盐度影响因子, 在细菌生长量、特定基因的分子水平分析细菌耐药性变化。本文的研究结果为不同盐度下对海水养殖动物细菌病的药物防控提供理论依据, 同时为细菌耐药性的深入研究提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用哈维弧菌是从2014年6月广东省某鲍鱼养殖场患脓疱病的鲍鱼中分离的, 经过诱导后为9H7R保存于-80 ℃。本实验从2019年8月起到2020年1月。细菌DNA抽提试剂盒(广州迈宝生物科技有限公司)；RNA试剂盒(广州迈宝生物科技有限公司)；反转录试剂盒(TaKaRa)；药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)营养琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；Premix(货号RR901A 50 µL反应*120次TaKaRa)；生理盐水(100 mL去离子水中加入0.85 g或0.9 g氯化钠, 高压灭菌)；1%琼脂糖凝胶。耐药基因gyrB为文献中所提供[13]。主要仪器: 电泳仪(美国Bio-Rad公司)、超净工作台、凝胶成像仪、移液枪、旋涡混合器、PCR 仪(日本TaKaRa公司)、荧光定量PCR仪(Lightcycler 480)、0.5 麦氏比浊管、平板、NanoDrop 2000超微量分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 不同盐度下生理生化特性分析

用营养琼脂培养基活化哈维弧菌, 28 ℃培养24 h, 接种到斜面培养基待培养17—24 h, 长出菌苔用8.5 ppt的无菌生理盐水洗脱。用0.5 麦氏比浊管比浊, 稀释成1.5×108cfu·mL-1的菌液分别在5、10、15、20、25 ppt盐度的LB固体培养基上均匀涂平, 倒置培养箱生长24—48 h, 做多组平行, 对生长后菌株大小进行比较, 选择优势菌测量, 对不同盐度生长的哈维弧菌数量比较, 选择平均四分区域法计量哈维弧菌数量, 平行取典型两组比较。生化鉴定将生长的斜面菌苔用3 mL, 8.5 ppt无菌生理盐水洗脱, 用0.5麦氏比浊管比浊, 加无菌生理盐水稀释成约1×108cfu·mL-1, 用吸管吸取2 滴(约0.06 mL)菌悬液加入每种微量生化管内, 进行分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇发酵试验, 糖产气实验等。放置培养温度为37 ℃的培养箱中, 设置固定的培养时间, 观察培养后的结果。

1.2.2 不同盐度下哈维弧菌药物敏感性测试

选用常用药敏纸片法(k-b 法), 四环素类、利福霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、β—内酰胺类、大环内酯类等抗生素按常规进行药敏试验, 参照 NCCLS 抗生素敏感试验操作标准及相关研究文献进行[14-16]。用 1 mL生理盐水洗脱已培养 17—24 h 斜面的哈维弧菌菌苔, 对照麦氏比浊管调整菌悬液浓度约为1.5×108cfu·mL-1, 取 300 µL 菌液均匀涂布于 Mueller-Hinton(MH)琼脂平板上, 放置 4—5 min, 用无菌小镊子分别取药敏纸片按要求均匀紧贴于培养基表面(每个方形平板培养基最多贴 16 张纸片, 药敏纸片直径为7 mm, 吸水量为 20 µL[17], 相邻纸片等距离> 20 mm, 纸片距离培养基边界> 15 mm。倒置于 28 ℃生化培养箱中培养24—48 h后, 用游标卡尺测量抑菌圈直径[18]。根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSI2008)标准判定结果, 对照相关参照将敏感范围分为(S)、中度(I)、耐药(R)三个区间。判定标准详见表1。

1.2.3 耐药基因检测及总RNA的提取

根据哈维弧菌的耐药表型, 选择与喹诺酮类耐药的基因为研究分子, 对五种不同盐度生长的哈维弧菌进行DNA提取, 参照试剂盒说明提取, PCR鉴定, 基因的反应条件95 ℃预变性 5 min, 95 ℃变性 1 min, 53.5 ℃复性 1 min, 72 ℃延伸 30 s, 30 个循环, 72 ℃延伸 10 min。电泳仪确定条带(1%琼脂糖凝胶0.5×TBE配制), 初步确定基因。

RNA提取参照试剂盒使用说明书, 盐度处理培养后的菌液各取３ mL离心, 接着溶菌、裂解、漂洗、洗脱缓冲、测总RNA的浓度和A260/A280、RNA溶液放置-80℃冰箱保存或直接反转录(根据试剂盒说明进行)。PCR反应体系为20 µL: Premix 2 × Ex Taq 10 µL, DNA 模板 2 µL, 上下游引物0.8 µL, dH2O 6.4 µL。

1.2.4 相对定量双△Ct法

耐药基因相对表达水平2ΔΔ(Ct), Δ=()()；

Δ(Δ)=Δ(实验组)(对照组)。

2 结果与分析

2.1 不同盐度对哈维弧菌生长的影响及生化鉴定

2.1.1 哈维弧菌生长影响

根据不同盐度生长的哈维弧菌, 在培养箱中生长24—48 h, 观察细菌个体, 进行优势菌株直径测量, 测量结果显示菌株随生长盐度的增加, 菌株越大, 采用平板计数法, 发现盐度在25时, 菌株数最多, 盐度为20的培养基生长的哈维弧菌数量较少, 细菌数量由多到少的相对应盐度显示: 25 ppt、10 ppt、5 ppt、15 ppt、20 ppt。本次结果表明, 高盐度生长的哈维弧菌数量较多, 菌株较大, 细菌生长速度较快；低盐度下生长的哈维弧菌数量相对少, 菌株偏小, 生长速度较慢。哈维弧菌的生长量及在不同盐度处理下菌株大小通过多组平行比较的统计具有研究意义。结果见表3。

表1 药物敏感性判断标准

表2 耐药基因的引物序列

2.1.2 哈维弧菌生化鉴定结果

5种不同盐度生长的哈维弧菌, 生化特性基本一致, 其中包括葡萄糖产气、肌醇、阿拉伯糖、蔗糖、甘露糖等生化指标均保持一致。1%NaCl葡萄糖磷酸盐胨水, 在15 ppt盐度和20 ppt盐度生长的哈维弧菌与其他盐度哈维弧菌生化鉴定结果有区别, 盐度为5 ppt、10 ppt、25 ppt的生长弧菌呈现多阳性现状, 在15 ppt盐度和20 ppt盐度生长的哈维弧菌生化管继续滴入一滴试剂, 结果显示与盐度为5 ppt、10 ppt、25 ppt的生长弧菌结果一致。因此, 不同盐度下生长的哈维弧菌, 生化特性不会发生变化。详见表4。

2.2 不同盐度培养的哈维弧菌药敏结果

经药敏试验鉴定, 不同盐度下培养的哈维弧菌耐药性发生变化。哈维弧菌在不同盐度下对阿奇霉素、氧氟沙星耐药性变化大, 敏感范围发生明显变化, 盐度为15 ppt和25 ppt时菌株对阿奇霉素敏感范围显示中度敏感, 其他盐度生长的哈维弧菌对阿奇霉素为敏感, 5 ppt盐度的哈维弧菌对氧氟沙星显示中度敏感, 其他盐度生长的哈维弧菌显示耐药, 阿奇霉素属于大环内酯类, 氧氟沙星属于喹诺酮类抗生素。发现哈维弧菌对喹诺酮类耐药, 筛选出的药物有诺氟沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、环丙沙星。此外, 哈维弧菌对阿莫西林、氨苄西林、青霉素、头孢哌酮等耐药。详细结果表5。

表3 哈维弧菌在不同盐度培养的平板计数比较

表4 5种盐度下哈维弧菌分离株生化试验结果

注: a1. 5 ppt盐度的培养菌株; a2. 10 ppt盐度的培养菌株; a3. 15 ppt盐度的培养菌株; a4.20 ppt盐度的培养菌株; a5. 25 ppt盐度的培养菌株; +. 多为阳性; –. 少数阳性; d.结果不确定; (+). 弱阳性。

表5 不同盐度培养的哈维弧菌药敏结果

注: a1.5 ppt盐度的培养菌株; a2.10 ppt盐度的培养菌株; a3. 15 ppt盐度的培养菌株; a4. 20 ppt盐度的培养菌株; a5. 25 ppt盐度的培养菌株。

2.3 不同盐度处理的哈维弧菌荧光PCR结果

2.3.1 哈维弧菌提取DNA及PCR鉴定实验结果

取培养的哈维弧菌提取DNA, 选取基因引物, 经过PCR鉴定, 在电泳仪上观察条带, 产物长度为234 bp且为一条清晰的条带与基因相符(设计了八个平行梯度的退火温度, 分别是64.0 ℃、63.1 ℃、61.6 ℃、59.3 ℃、56.6 ℃、54.3 ℃、52.8 ℃、52.0 ℃), 送天一公司测序, 结果显示与哈维弧菌相似度最高, 证明哈维弧菌中含有基因如图1所示。

2.3.2 荧光PCR鉴定基因结果

不同盐度处理后的哈维弧菌中RNA显示的A260/A280比值为1.80—2.20。当基因在不同盐度的处理下, 盐度在5 ppt时,基因的Ct值最小(反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数), 因此表明表达量最高, 符合药敏试验结果。详细结果见表6。

图1 PCR产物凝胶电泳图

Figure1 The PCR products of Agarose gel electrophoresis

3 讨论

3.1 不同盐度培养对哈维弧菌生理生化影响

哈维弧菌感染对象广泛, 可引起大黄鱼、斜带石斑鱼、对虾、杂色鲍等经济动物的大规模爆发疾病。二十世纪至今, 哈维弧菌导致的感染给世界范围内的水产养殖场带来严重的经济损失[19]。由于哈维弧菌嗜盐, 在不同盐度条件下, 哈维弧菌菌株生长具有差异性。因此本实验设计五种不同盐度生长细菌, 进行比较, 盐度因素对细菌生理生长的影响, 在25 ppt盐度下生长的哈维弧菌菌株直径最大, 细菌量多, 5 ppt盐度生长的哈维弧菌菌株直径小且生长缓慢, 细菌数量较少。生化鉴定结果显示, 在不同盐度下生长的哈维弧菌生化指标不变, 说明盐度条件不影响生化特性。在不同盐度下, 哈维弧菌的生长形态上发生明显变化。因此, 在培养哈维弧菌时选择较高盐度培养基, 在对细菌不同盐度的培养, 实际生产中可用来控制细菌的生长量, 减少水产养殖业的细菌感染。在生化鉴定上, 不同盐度生长的哈维弧菌生化特性没有影响, 因此在生化鉴定能够准确确定细菌种类, 为防治细菌病的研究提供依据。

表6 不同盐度培养的哈维弧菌的内参基因、目的基因的Ｃt 比较

3.2 不同盐度培养下哈维弧菌耐药性的差异

通过药敏纸片法在不同盐度生长的哈维弧菌抑圈直径的比较, 判定耐药范围变化, 最终确定耐药性的变化, 这种方法能够快速检测细菌之间耐药性表型变化。药敏结果显示, 哈维弧菌对诺氟沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星的喹诺酮类耐药且在不同盐度下生长的哈维弧菌对氧氟沙星敏感范围发生明显变化, 5 ppt盐度下生长的哈维弧菌对氧氟沙星显示中度敏感, 其他盐度下的哈维弧菌显示耐药。

对应选定的喹诺酮类耐药基因, 检测到哈维弧菌中存在该耐药基因, 对不同盐度培养的哈维弧菌的耐药基因进行相对定量检测, 从细菌的耐药基因型变化, 确定耐药性的变化。盐度为5 ppt生长的哈维弧菌,基因的Ct值最小, 表达量显示最高, 其它盐度生长的哈维弧菌耐药基因的Ct值较高, 显示的表达量偏低, 与药敏试验结果一致。实验表明, 不同盐度生长的哈维弧菌耐药性会发生改变, 因此, 在调节盐度条件可改变哈维弧菌的耐药性, 通过这种特性, 在对哈维弧菌耐药性的研究, 可以采取对盐度的调控, 在哈维弧菌感染病的防治上有一定的作用。

2012年—2014年中国南海海水养殖鱼类病原菌哈维弧菌分离株的耐药性分析中, 报道了海南和广东地区分离株对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星抗生素敏感性高, 对阿莫西林、呋喃唑酮的耐药率高, 显示哈维弧菌对喹诺酮类药物具有高敏感性[20]。不同盐度影响下, 哈维弧菌对喹诺酮类抗生素耐药性变化大, 可能是海水养殖中喹诺酮类抗生素使用较多, 从而影响了细菌耐药性, 1994年氟喹诺酮被我国准许投入使用, 是在动物上首个被使用的喹诺酮类药物[21]。有报道认为氧氟沙星是治疗急性菌痢的首选药物, 有效率可达90%[22]；唐建华等关于氧氟沙星药物的研究进展中提到氧氟沙星大的量使用, 造成了严重危害[23]。本实验不同盐度下培养的哈维弧菌对氧氟沙星的敏感范围不同, 这可能由于氧氟沙星的大量使用, 使哈维弧菌的耐药性发生变化。

4 结论

研究结果表明, 受盐度因素影响, 哈维弧菌在培养基上的菌落形态及细菌数量会发生变化, 这种特性可以作为控制细菌生长的重要因素；结合药敏试验及qPCR检测结果, 哈维弧菌对喹诺酮类抗生素显示耐药, 且不同盐度下细菌的耐药性不同, 实验结果可为海水动物细菌病的防控提供参考。

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Studies on the influence of salinity in drug resistance ofand the expression experiment of drug resistance gene

Chen Xiucheng1,2,Wang Jiangyong1,*, Sun Jingfeng2

1. Huizhou University, Huizhou 516007, China 2. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China

For the study of different salinity effect on physiological, biochemical and drug resistance of, we investigatec the changes of drug-resistant phenotype and drug-resistant gene ofatdifferent salinity using9H7R; the salinity of seawater was 5, 10, 15, 20, 25 ppt, and Kirby-Bauer paper diffusion method was performed. According to NCCLS antibiotic sensitivity test operation standard, the change of drug resistance ofin different salinity was studied,then bacterial RNA was extracted, reversed transcription and qPCR were performed, and relative expression levelswere calculated according to specific genes.The results showed thatgrew at different salinities.The resistance to quinolones changed and the expression ofwas affected.

; salinity; antibiotics; drug resistance; fluorescence quantitative PCR

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.06.015

S944

A

1008-8873(2022)06-123-07

2020-10-07;

2021-01-17

国家现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-49); 惠州学院教授、博士启动项目(2020JB065); 广东省教育厅海洋贝类生态养殖与病害防控创新团队(2021KCXTD057)

陈秀程(1992—), 女, 江苏盐城人, 硕士研究生, 从事贝类病害研究, E-mail: 1369330616@qq.com

通信作者:王江勇, E-mail: wjy104@163.com

陈秀程, 王江勇, 孙敬锋,等. 盐度对哈维弧菌耐药性的影响及耐药基因的表达实验研究[J]. 生态科学, 2022, 41(6): 123–129.

Chen Xiucheng, Wang Jiangyong, Sun Jingfeng, et al. Studies on the influence of salinity in drug resistance ofand the expression experiment of drug resistance gene[J]. Ecological Science, 2022, 41(6): 123–129.