杨艳丽，杨宇航，王璐瑶，索化夷，王洪伟，张玉*

1(西南大学 食品科学学院, 重庆, 400700)2(西南大学 食品科学与工程国家实验教学示范中心，重庆, 400700)

柠檬 (Citruslimon)年产量约占世界柑橘总产量的9%，其富含柠檬酸、类黄酮、维生素C、维生素A、维生素E以及Ca、Fe、Zn等多种矿物质及微量元素，具有清除自由基、降低胆固醇、预防坏血病等功效[1]。目前，仅有20%的柠檬被加工，加工产品主要为柠檬干片，虽然市场上也有少量的柠檬果酒，但是这部分柠檬酒以调配酒为主，发酵型较为罕见。此外我国的酒类市场规模已达亿万级别，尽管低度酒所占市场份额较小，但是近几年其呈现良好的发展趋势，品类不断增长[2]。而相较于白酒、啤酒等传统酒类，柠檬酒逐渐成为酒水消费主力军的年轻人更愿意消费可自主掌控饮酒体验、口味丰富甘甜的低度酒。因此生产出品质较好的发酵型低度柠檬酒既可以为柠檬的深加工提供途径，同时也能够满足市场需求。

目前国内外有关柠檬酒的研究较少，且主要集中在发酵工艺优化、发酵菌种筛选、脱苦技术及澄清工艺探索等方面。何雪梅等[3]发现发酵青柠檬酒的最佳工艺为添加0.25%的安琪RW酵母、可溶性固形物含量25%、pH 2.9，制得的成品酒酒精度为13.2%vol。梅明鑫等[4]建立了柚皮苷和柠檬苦素脱除率的二元回归方程，并确定了适宜的脱苦处理方法为添加0.55 g/100 mL β-环糊精于42 ℃下处理77 min。

尽管酵母可以在发酵阶段为果酒产生大量的乙醇，但此时酒体并不成熟，口感也较为粗糙和酸涩，而在陈酿期间，果酒通过缩合、氧化还原等反应，其酒体会变得更加饱和[5]。所以，明确最佳陈酿时间既可以更好地把控发酵型低度柠檬酒的品质，也能够更好地协调果酒的生产，节约人力物力，减少生产成本。而目前关于果酒陈酿过程中的品质变化的研究主要针对于葡萄酒，还未见针对柠檬酒陈酿品质的研究。本文对不同发酵和陈酿阶段柠檬酒的挥发性成分、理化性质、感官品质进行了测定和分析，探究发酵和陈酿过程中柠檬酒的品质变化以及柠檬酒的最佳陈酿时间，以期为柠檬酒的生产和加工提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

尤力克柠檬、白糖，重庆永辉超市；NaOH、酚酞指示剂，重庆市钛新化工有限公司；2-辛醇(GC标准品)，重庆市金喜鹊科技公司；安琪果酒酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LHS-50SC恒温恒湿培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；CM-5分光式色差仪，日本柯尼卡美能达控股公司；WZS-32手持式糖度计，上海仪电物理光学仪器有限公司；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；手动进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酿造工艺流程

挑选→去籽→榨汁→成分调整→灭菌→接种→发酵→原酒→陈酿

操作要点：挑选大小均匀的柠檬，加入3倍质量的纯净水榨汁,使用纱布过滤残渣，使用白砂糖调整糖含量为20%(质量分数，下同)，70 ℃下加热5 min杀菌，冷却到30 ℃以下时，接种0.12%(体积分数)活化后的酵母菌，置于32 ℃的培养箱中发酵10 d，发酵完成后转入到陈酿罐中于4 ℃下避光陈酿样品分组为：柠檬汁(f-0)、发酵10 d(f-10)、陈酿7 d(a-7)、陈酿14 d(a-14)、陈酿28 d(a-28)、陈酿42 d(a-42)。

1.3.2 柠檬酒理化指标的测定

可溶性固形物(折光计法)、滴定酸 (氢氧化钠滴定法, 以柠檬酸计)、酒精度(酒精计法)、pH值 (pH计测定) 的测定方法参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 色泽

柠檬酒的色泽是其品质的重要指标，取50 mL柠檬酒用色差仪在透射模式避光条件下测定色泽，用L、a和b表示。

1.3.4 GC-MS分析

参照郑淑丹等[6]的方法并略作修改。

取4 mL稀释8倍后的柠檬酒加入到15 mL样品瓶中，并加入60 μL的2-辛醇(32 g/L)内标物、1 g NaCl和磁力搅拌子，50 ℃下顶空萃取20 min。萃取后将萃取头插入GC进样口，解吸5 min。

GC条件：色谱柱DB-5MS (30 m×0.25 mm, 0.25 mm)；升温程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后8 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；He流量1.0 mL/min；无分流进样；进样口温度：250 ℃。MS条件：电子电离源；离子源温度250 ℃；接口温度250 ℃；扫描速率全程35～450m/z。

定性定量分析：GC-MS实验数据由NIST18.0数据库的相似度检索进行定性。以2-辛醇为内标半定量，各化合物浓度按照公式(1)计算：

(1)

1.4 感官分析

使用Flash Profile(FP)法进行柠檬酒感官评价，具体操作参照文献[7]。从本校中招募12名未参加过感官分析培训的本科生(5男7女)作为本次实验的感官评定小组。实验开始前向感官评定小组成员介绍FP法和实验流程。由12名感官评价人员对6个发酵阶段的柠檬酒进行感官评价，从外观、香气、风味、余味等各方面尽可能多地产生描述样品间差异的不代表情感的感官描述词，经汇总讨论形成柠檬酒感官描述词表，每位评价人员从该表单中选取自己能感知到差异的描述词，根据所选描述词在评价表上对样品进行强度排序。评价表上有多条15 cm长的线段，每条线段从左到右表示感官性质由弱到强。感官实验完成后，收集所有表单测量每一感官词下每一样品对应的线段长度，即为该样品该感官属性的强弱。

1.5 数据分析处理

2 结果与分析

2.1 柠檬酒在发酵过程中品质指标的变化

由表1可知，随着发酵和陈酿的进行，柠檬酒的可溶性固形物含量和pH值逐渐降低，分别由f-0的20.17%和2.72下降至a-42的11.53%和2.19。总酸含量逐渐增加，a-14，a-28，a-42的总酸含量(9.24、9.20、9.35 g/L)无显著性差异(P>0.05)。酒精度先增加后降低，a-28时达到峰值4.93%vol，a-42和a-48的酒精度并无明显差异(P>0.05)。

表1 不同发酵阶段的柠檬酒的理化特性Table 1 Physicochemical characteristics of lemon wine in different fermentation stages

发酵开始时提供了充足的糖类物质和适宜的发酵温度，以酵母为主的微生物生长繁殖活动旺盛，不断将糖类物质转化为乙醇、酚类、芳香族氨基酸以及多种酸类物质[8]，故在发酵和陈酿过程中酒精度和总酸含量增加。而当乙醇的浓度达到一定量时，酵母的生命活动便会被抑制，从而导致酸类物质和乙醇的生成速率减慢。此外，后3个阶段的总酸含量无显著性差异(P>0.05)，也有可能是有机酸与氨基酸相互缓冲导致[9]。pH会影响酵母的生长和最终产品的特性[10]，是果酒发酵的一个关键因素，而酸类物质的积累一定程度上降低了柠檬酒的pH。

使用L值、a值、b值、彩度值C和总色差ΔE来衡量陈酿和发酵过程中的柠檬酒的颜色变化。如图1所示，除f-0的a值(-0.61)为负值外，其余柠檬酒的a值为正且差异显著(P<0.05)。a-42最接近红色。ATANASOVA等[11]提出红酒中花青素和单宁酸的转化会导致红色加深。另外，f-0的b值最小(25.51)，a-42的b值最大(30.17)，可能是柠檬酒在发酵和陈酿过程中产生了黄色的物质。ES-SAFI等[12]的研究表明在发酵过程中由酚类化合物氧化形成的醌类化合物，在聚合之后会形成黄棕色色素，此外酚类物质氧化后产生的H2O2可将乙醇氧化为乙醛，乙醛在酒石酸氧化产生的二聚体的作用下进一步形成棕色物质。C值越大说明该物体颜色饱和度越高，反之则越低。f-0的色彩饱和度最低，a-42的色彩饱和度最高(5.61)。总色差ΔE能够准确地反映物体表观色彩的准确性，5个发酵阶段柠檬酒的颜色与柠檬汁颜色的色差均在25以上，肉眼可以辨别两者的颜色差别。

图1 不同发酵阶段柠檬酒色泽Fig.1 Color of lemon wine in different fermentation stages注：不同小写字母表差异显著(P<0.05)

2.2 不同发酵阶段柠檬酒的挥发性成分

在柠檬汁和5个时期的柠檬酒中共检出109种挥发性成分，包括酯类15种、醇类25种、萜烯类36种、酸类5种、醛酮类14种和其他14种(表2)。不同发酵阶段的柠檬酒的挥发性成分种类和含量不同。f-0、f-10、a-7、a-14、a-28、a-42中依次检测到56、50、47、47、59、55种化合物，挥发性成分的物质含量依次为350.55、127.58、110.48、121.76、135.27、160.80 mg/L，从a-14到a-42，挥发性成分的含量和数量均呈现增长趋势。

酯类是果酒的特征性成分，其在柠檬酒中的含量虽然不多，但是能够赋予果酒柔和的口感和持久的香气。f-10中仅检测到4种酯类，占比1.8%，分别是乙酸橙花酯(2.62 mg/L)、乙酸香叶酯(2.16 mg/L)、硬脂酸甲酯(0.39 mg/L)和棕榈酸甲酯(1.13 mg/L)，其中乙酸香叶酯和乙酸橙花酯在所有阶段中都有检出，是柠檬酒的共有物质。乙酸橙花酯呈现橙花、玫瑰花的香味，乙酸香叶酯具有柑橘香。f-10、a-7、a-14、a-28、a-42的酯类挥发性成分含量依次为16.24、15.81、20.79、9.91、10.47 mg/L，呈现先升高后降低的趋势，可能是醇类和酸类在酿酒酵母相关酶的作用下被转化为酯，而进行到陈酿后期，酯类化合物被微生物或相关酶分解[13]。癸酸乙酯、壬酸乙酯、香叶酸甲酯、辛酸乙酯、乙酸松油酯、乙酸香茅酯、月桂酸乙酯在5个时期的柠檬酒中均被检测到。癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸橙花酯的含量在a-28明显降低，可能是发生了水解反应。

醇类是果酒发酵成功与否的重要检测指标，糖类分解代谢以及氨基酸脱羧、脱氨后均会产生醇[14]。陈酿阶段，柠檬酒的醇类物质不断积累，a-42达到96.44 mg/L，在所有阶段的柠檬酒中最高。f-0中的醇类含量相对较高，达到了80 mg/L，而f-10中显著降低，仅有39.1 mg/L，这与曾竟蓝[5]的研究结果一致，可能是在发酵阶段产香酵母利用醇类物质生成了酯[15]。少量的高级醇便能够使果酒产生优雅的香气[16]。异戊醇、芳樟醇、橙花醇、α-松油醇、D-香茅醇等高级醇的含量在陈酿时不断增加，因为氨基酸通过Ehrlich途径被转氨为氨基酸α-酮酸，然后脱羧成醛，最后通过还原反应变成高级醇[17]。而当高级醇的浓度高于400 mg/L时，其他挥发性化合物香气会被抑制，并产生令人不快的风味[18]。(-)-4-萜品醇、α-松油醇、芳樟醇、异香叶醇是含量最多的高级醇类物质，是柠檬果酒的特征风味化合物，在酿造过程中均先降低后升高，但是异香叶醇在f-0中含量为34.7 mg/L，而发酵后含量均低于0.15 mg/L，可能是在发酵的过程中被转化为其他物质。α-松油醇、橙花醇、芳樟醇、香茅醇、β-松油醇、葑醇在所有阶段中均有检出。其中芳樟醇对柑橘类鲜果和果汁风味的形成起着重要作用，是优质果皮油和橙汁中最重要的成分之一[19]。

萜烯类物质是柠檬的主要挥发性成分，赋予了柠檬独特的香气。在f-0中共检出了21种萜烯类化合物，含量为181.28 mg/L，相对含量为51.71%，其中柠檬烯、β-蒎烯、萜品烯、β-月桂烯为f-0的主要萜烯类化合物。f-0中柠檬烯的含量高达99.36 mg/L，但在其余阶段中未被检出，可能是在发酵过程中被转化为D-柠檬烯。f-10、a-7、a-14、a-28、a-42中萜烯类化合物的含量依次为56.31、58.67、58.12、49.78、51.67 mg/L，相比f-0，发酵柠檬酒的萜烯类化合物减少很多，主要是因为不饱和烯烃在酿造过程中氧化分解，转化为醇类、酸类、醛酮类等对果酒品质有重要贡献的风味物质[5]。D-柠檬烯、β-蒎烯、α-蒎烯、石竹烯、萜品烯、β-月桂烯、β-红没药烯是发酵柠檬酒的主要萜烯化合物，其中D-柠檬烯是各发酵柠檬酒中含量最高的的萜烯类化合物，但是RODRGUEZ等[20]发现D-柠檬烯对甜橙气味的形成贡献不大，并认为其可能通过在复合香气混合物中作为其他化合物的溶剂与其他甜橙气味成分协同作用。

来源于原料本身以及酿造过程中产生的醛类和酮类物质对果酒的独特香气的形成起着至关重要的作用。但是在发酵柠檬酒中仅有少量的醛酮类化合物被检测到，而在f-0中则检测到12种醛酮类化合物，含量为76.91 mg/L，其中(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、柠檬醛、壬醛、癸醛为柠檬汁的主要醛类化合物。酸类物质不仅能够赋予果酒清冽的口感，同时在酯类物质的形成过程中也起着重要的作用，果酒中的酸类物质主要来源于酿酒酵母的代谢活动和醇类物质的氧化。但本次仅检测到5种挥发性酸类，分别是辛酸、癸酸、乙酸、紫苏乙酸和2-羟基肉豆蔻酸，且各种酸类化合物的含量均较低，辛酸在所有发酵阶段中均被检测到。共检测到14种其他类化合物，其含量随发酵时间的延长先升高后降低。

表2 不同发酵阶段柠檬酒的挥发性成分含量Table 2 Content of volatile components of lemon wine in different fermentation stages

续表2

续表2

2.3 感官分析

FP法是近年来广为应用的快捷高效的感官评价方法，该方法要求感官评价人员对样品的感官属性进行强弱排序，从而对样品进行区分。由图2可知，6个发酵阶段的柠檬酒样品可被区分开。f-0和f-10均位于Y轴的左侧，但是相距较远，因发酵期酵母菌生长繁殖活动最为旺盛，利用糖类产生了大量乙醇。但是发酵完成后柠檬酒被转入陈酿罐中，并置于4 ℃的低温下，这极大地抑制了酵母的生命活动，再加上发酵过后可供利用的糖类物质大量减少，导致陈酿期间的柠檬酒品质变化相对较小。a-7和a-14的柠檬酒在载荷图中相距较近，a-42和a-28也较为接近，说明它们具有相似的感官性质。

图2 不同发酵阶段柠檬酒的GPA载荷图Fig.2 GPA load diagram of lemon wine in different fermentation stages

由图3可知，f-0位于柠檬香(香气)组群附近，这说明柠檬汁在柠檬香(香气)方面表现突出，这与挥发性成分的测定结果保持一致，萜烯类化合物赋予柠檬特殊的香气，而柠檬汁中萜烯类化合物的含量最多。f-10、a-7、a-14均位于黄色(外观)和酸味(风味)附近，说明它们在这两方面表现接近。a-28更靠近酒精味(香气)，这与酒精度测定结果保持一致，a-42与涩味(风味)、苦味(风味)更为接近。综合感官评价，a-28的感官品质更好。

图3 不同发酵阶段柠檬酒的GPA感官属性载荷图Fig.3 GPA sensory attribute load diagram of lemon wine in different fermentation stages注：P1-P12表示第1-12位评价人员；ar代表香气类感官属性; f代表风味类感官属性;ap代表外观类感官属性; at代表风味类感官属性

3 结论与讨论

以尤力克柠檬为原料酿造柠檬酒，对f-0、f-10、a-7、a-14、a-28、a-42柠檬酒的理化指标、挥发性组分和感官品质进行研究。结果表明：随陈酿时间的延长，可溶性固形物含量逐渐降低，酒精度逐渐升高，并在a-28达到峰值，此后酒精度有所下降。酸类物质在陈酿过程中不断积累，pH也呈现下降的趋势。不同发酵和陈酿时期的柠檬酒的色泽并未呈现明显变化趋势。a-28和a-42的理化指标较为相近。

在所有阶段的柠檬酒中共检出109种挥发性成分，包括酯类15种、醇类25种、萜烯类36种、酸类5种、醛酮类14种和其他14种。不同陈酿阶段柠檬酒的挥发性成分含量和构成比例均不同，随陈酿时间的延长，挥发性成分的含量不断增多，醇类挥发性成分不断积累，酯类挥发性成分先增加后减少，萜烯类挥发性成分在各阶段的柠檬酒中均有检出，且占比均在40%～60%。酸类、醛酮类和其他类在柠檬酒中的占比均较小，但是醛酮类在柠檬汁中的占比较大。挥发性成分的实验结果表明a-28和a-42整体较优，二者挥发性成分的构成较为相似。

通过FP法发现不同发酵阶段的柠檬酒可以被明显区分，同时得到的感官实验数据与柠檬酒理化指标和挥发性成分检测结果的重合度较高，但是在感官实验中a-42更靠近于涩味(风味)、苦味(风味)组群附近，而a-28的柠檬酒更靠近于酒精(风味)，所以尽管a-28和a-42在理化指标和挥发性成分的构成上较为相似，但是a-28的感官品质要优于a-42，因此低度发酵柠檬酒的最佳陈酿时间为28 d。