周晓玲,姚 迪

恩施土家族苗族自治州中心医院:1.检验科；2.呼吸与危重医学科,湖北恩施 445000

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，导致肺癌发生的原因较多，其中与生活方式有关的主要有吸烟、长期应激压力以及遗传等因素[1]。然而吸烟史并不是肺癌发生的决定性因素，且不同的个体对吸烟所产生的尼古丁等致癌物质代谢能力存在差异，这种个体差异影响了肺癌的发生率[2]。目前关于吸烟人群体内的多种化合物代谢酶类基因与肺癌的发生、发展是否存在联系尚缺乏系统性研究。细胞色素酶P450(CYP450)是一类在人体内广泛分布的氧化还原酶，参与体内多种关键物质的代谢。CYP450家族中的细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)被报道参与烟草中亚硝酸胺和苯胺的代谢[3]。除CYP450外，有研究报道称谷胱甘肽S转移酶(GST)的多态性与多种癌症的发生和发展有关[4]。在GST家族中，由谷胱甘肽S转移酶M1(GSTM1)表达水平及基因型被报道与胃癌、肺癌等癌症的发生存在关联性[5]。流行病学调查显示，GSTM1的基因多态性可分为存在活性的GST(+)和无活性的GST(-)两种，且在不同人种间GSTM1的基因频率存在较大差异。本研究拟通过聚合酶链式反应(PCR)测序的方式了解CYP2E1和GSTM1基因型在吸烟人群中的分布及两者与吸烟人群非小细胞肺癌发生之间的关系，旨在为肺癌预防提供理论基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年1月至2020年1月间在本院就诊并确诊为非小细胞肺癌患者70例作为肺癌组，其中男42例，女28例；平均年龄(57.6±10.7)岁；鳞癌26例，腺癌31例，腺鳞癌13例。所有患者均经术后病理检查确诊，且有10年以上吸烟史，每日吸烟10支及以上。另选取同期住院的肺良性疾病患者70例作为对照组，其中男50例，女20例；平均年龄(53.4±9.2)岁；均无肺癌家族史和职业性致癌接触史，且有10年以上吸烟史，每日吸烟10支及以上。排除标准：并发有其他癌症或具有癌症史；年龄>80岁。两组患者在年龄、性别等一般资料比较差异无统计学(P>0.05)，具有可比性。

1.2标本采集和DNA提取 于清晨空腹采集所有研究对象静脉血2 mL，将标本置于抗凝管中拟用于DNA提取。使用上海生工生物责任有限公司提供的血液基因组提取试剂盒，操作步骤严格依据说明书进行，提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳测试验证质量和浓度。质量和浓度合格的标本保存于-20 ℃冰箱待后续PCR扩增和测序。

1.3主要仪器和试剂 通用电泳仪(美国伯乐责任有限公司)、凝胶成像系统(美国伯乐责任有限公司)、基因链式反应扩增仪(美国赛默飞责任有限公司)。主要试剂：PCR合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、琼脂糖凝胶(西班牙Biowest责任有限公司)、TAE缓冲液(上海生工生物责任有限公司)。

1.4基因PCR扩增和测试 本文所用引物如下，CYP2E1基因使用引物：CYP450上游引物为5'-TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG- 3',CYP450下游引物为5'-CCA GTC GAG TCT ACA TTG TCA-3'；GSTM1基因使用引物：GST上游引物为5'-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAGC-3',GST下游引物为5'-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3'。采用三步法PCR，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 15 s。反应35个循环。PCR产物经电泳确认条带正确后回收，并测序。CYP450目的片段长度为410 bp，GST目的片段长度为216 bp。均采用测序的方式确定CYP450基因型为 c1型或c2型及GST的基因型为GST(+)或GST(-)。测序服务由北京擎科生物科技责任有限公司负责。

2 结 果

2.1CYP450基因型分布及与非小细胞肺癌风险相关性 对肺癌患者和对照组患者CYP2E1基因的多态性进行检测和比较发现，肺癌组和对照组c1/c1、c1/c2、c2/c2基因型的检出率分别为40.0%(28/70)、35.7%(25/70)、24.3%(17/70)和27.1%(19/70)、41.4%(29/70)、31.4%(22/70)，以c2/c2基因型个体OR值为1，c1/c1基因型个体肺癌OR为1.907(95%CI=0.413～8.209,P<0.05)，见表1。

表1 CYP450基因型分布及与非小细胞肺癌风险相关性[n(%)]

2.2GST基因型分布及与非小细胞肺癌风险相关性 对肺癌组和对照组患者GSTM1基因的多态性进行检测和比较发现，肺癌组和对照组GST(+)和GST(-)基因型的检出率分别为40.0%(26/70)、35.7%(44/70)和51.4%(36/70)、48.5%(34/70)，以GST(-)基因型个体OR值为1，GST(+)基因型个体肺癌OR为0.546(95%CI=0.109～1.104,P<0.05)，见表2。

表2 GST基因型分布及与非小细胞肺癌风险相关性[n(%)]

2.3CYP450基因型与GST基因型共同分布对非小细胞肺癌风险的影响 进一步考察两基因是否存在协同效应，本研究以c1/c2+c2/c2/GST(+)肺癌OR值为1，c1/c2+c2/c2/GST(-)、c1/c1/GST(-)、c1/c1/GST(-)基因型个体肺癌的OR值分别为2.315，2.412，4.878，其中c1/c1/GST(-)基因型个体肺癌的OR值差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 CYP450基因型与GST基因型共同分布对与非小细胞肺癌风险影响[n(%)]

3 讨 论

近年来的流行病学统计显示，肺癌仍然是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，尤其是在男性中，是因癌症死亡的最主要癌症类型[1,6]。在肺癌中，以非小细胞肺癌为主要发病类型。虽然非小细胞肺癌患者预后优于小细胞肺癌患者，但仍是因癌症死亡的主要病因之一。流行病学显示，非小细胞肺癌的发生除与如吸烟史有关外，还与遗传因素有关如抑癌基因功能缺失或原癌基因突变等。吸烟史是肺癌发生最重要的危险因素，然而并非所有的吸烟者最终都会发展为非小细胞肺癌[7]。本研究拟探讨人体参与致癌分子解毒代谢的两类主要酶类：Ⅰ相代谢酶CYP450和Ⅱ相代谢酶谷胱甘肽S转移酶基因型与吸烟人群癌症发生率之间的相关性。

CYP450属于细胞解毒超家族之一，是人体内重要的Ⅰ相代谢酶，负责致癌物质生物转化中的氧化还原。将具有毒性或致癌化合物代谢为无毒性的代谢产物。人体内负责合成CYPP450的基因有十余种，可大致分为CYP1、CYP2和CYP3三个家族，三者在肝脏中P450总量的70.0%以上并负责多数内源性和外源性化合物的代谢。其中，CYP2E1被报道参与癌症相关化合物的代谢。CYP2E1基因的多态性，可以大体分为c1和c2两个基因型。其中c2基因型表达的CYP2E1具有催化功能和代谢香烟烟雾中亚硝酸胺的活性，而c1基因型表达的CYP2E代谢亚硝酸胺的活性则较弱[8]。在对人群中c1和c2基因型分布的研究中发现，不同人群中c1和c2的分布差异较大。在肺癌组和对照组CYP450基因多态性的比较中发现，两组患者中c1/c1、c1/c2、c2/c2基因型的检出率分别为40.0%(28/70)、35.7% (25/70)、24.3% (17/70)和27.1% (19/70)、41.4% (29/70)、31.4% (22/70)。在对照组人群中c1和c2等位基因的比例大致为1∶1，c2等位基因频率相较于其他国内研究更高[9]，而在肺癌组中，这一比例与国内其他研究相当[10]。以c2/c2基因型个体肺癌OR值为1，c1/c1个体肺癌OR为1.907，经年龄、性别等因素校正后c1/c1和c2/c2纯合子之间的差异具有统计学意义。这提示，在吸烟人群中携带c1纯合体基因的个体发生非小细胞肺癌的概率会增加，进一步证实CYP450参与了尼古丁等吸烟相关致癌物质的氧化代谢，而转录因子结合位点存在突变的c1纯合子降低了CYP450的表达水平从而影响了对致癌物质的代谢。WU等[11]研究发现在台湾人群中，c2纯合子的频率仅为0.24%，而这一比例在日本人群中则高达24.00%～27.00%。有研究报道，c1纯合子与肺腺癌的发生存在显著相关性[12]。因此，是影响吸烟人群非小细胞肺癌发生的遗传因素之一。

GST与P450类似也是细胞解毒蛋白超家族之一，大致包括GSTA、GSTK、GSTM、GSTP1、GSTS、GSTT、GSTZ1和GSTO等8个家族。与P450属于Ⅰ相代谢酶不同，GST属于Ⅱ相代谢酶。Ⅱ相代谢酶以与特定毒性物质不可逆结合的方式参与机体内毒性物质清除的过程。8种主要的GST蛋白在不同组织中分布存在明显差异，且特异性结合的毒性物质也存在区别。GSTA主要表达于肝脏参与类固醇代谢途径调节；GSTO则参与砷类毒性化合物的代谢；GSTZ1参与毒性化合物二氯醋酸的代谢；GSTM则是与癌症发生最为密切，据报道，GSTM基因多态性和表达水平与多种癌症的发生和发展存在相关性[13]。依据是否能表达具有活性的GSTM蛋白，GSTM的基因多态性可分为GSTM(-)和GSTM(+)两类，其中GSTM(-)基因编码的GSTM蛋白因缺乏管教的氨基酸残基而缺乏活性，因此GSTM(-)纯合子个体缺乏GSTM蛋白催化功能。本研究发现肺癌组和对照组GST(+)和GST(-)基因型的检出率分别为37.1% (26/70)、62.9% (44/70)和51.4% (36/70)、48.6% (34/70)。在对照组中GST(-)基因型的检出率与已有报道相近[14]，而在非小细胞肺癌患者中GST(-)基因型的检出率相对较高。以GST(-)基因型个体肺癌OR值为1，GST(+)个体肺癌OR为0.546，经年龄、性别等因素校正后GST(-)和GST(+)纯合子及杂合子之间的差异具有统计学意义。提示GST同样参与吸烟致癌物质的代谢。因此，在存在GST功能缺失的GST(-)纯合子个体中肺癌的发生概率显著高于存在GST功能的人群。对不同人群中，GST基因多态性的调查显示，GSTM(-)纯合子个体在澳大利亚人中约为67.0%、高加索人中约为50.0%、尼日利亚人中约为20.0%[15]。同时，GSTM(-)纯合子与结肠癌、肺癌和膀胱癌的发生存在相关性[13]。且还与急性髓性白血病患者的化疗的疗效相关[16]。因此，有理由相信，CYP450和谷胱甘肽S转移酶的基因多态性会影响吸烟人群的非小细胞肺癌灵敏度。

最后本研究进一步考察了两者单独和共同作用的影响，发现c1/c1纯合同时GST(-)纯合子个体肺癌灵敏度是c1/c2+c2/c2杂合以及GST(+)人群的4.8倍，提示两者参与不同吸烟相关致癌物质的分解代谢，因此当两个基因都失效时，个体肺癌风险显著增加效果较单一基因失效更为显著。然而，本研究存在纳入的样本量限制，后期需扩大样本量，进一步分析吸烟人群P450和GST基因多态性与肺癌易感性关系；并深入探究P450和GST基因多态性导致肺癌的可能机制。

综上所述，CYP2E1和GSTM1可能参与了吸烟相关致癌物质的解毒过程。携带功能缺失的GSTM1(-)和CYP450 c1/c1基因型人群非小细胞肺癌的风险显著增高，同时携带两个危险基因型的吸烟人群非小细胞肺癌发生风险提高约5倍。