张省委,林 博,韩 冉,张万宇

北京中医药大学东方医院检验科，北京 100078

慢性乙型肝炎(HBV)是临床常见的传染病之一，随着疾病的进一步进展，可逐步发展为肝硬化、肝癌以及终末期肝病[1]。目前，临床通过对慢性HBV患者的抗病毒治疗，可显著降低疾病的进展。常见的抗病毒治疗药物主要包括干扰素以及核苷酸类似物，临床研究发现，通过对慢性HBV患者采取干扰素治疗，可获得较高的乙型肝炎E抗原(HBeAg)以及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清转换率[2]，但是具有较高的不良反应，同时其较高的价格导致患者的依存性较低[3]。微小核苷酸主要存在于真核细胞生物以及病毒中。有研究报道显示，miR-125b-5p、miR-122-3p不仅对于乙型肝炎的诊断具有积极的意义，同时在一定程度上对HBV的耐药性判断具有一定价值[3]。本文主要通过研究miR-125b-5p、miR-122-3p的表达水平，来探讨其与HBV患者肝功能、免疫功能的关系，同时对治疗效果进行预测分析，为临床诊断以及治疗效果监测提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本文采取前瞻性研究，选择2019年1月至2021年1月在本院进行HBV治疗的120例患者为病例组，其中男66例，女54例；年龄39～59岁，平均(44.72±2.37)岁，病程2～4年，平均(3.01±0.22)年；平均体质量指数(BMI)为(24.11±2.09)kg/m2。HBV的诊断参考《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》[4]中对病毒性肝炎的诊断标准。纳入标准：(1)满足上述诊断者；(2)入组前2周未使用抗病毒或免疫抑制剂。排除标准：(1)对本研究药物过敏患者；(2)哺乳期或妊娠期妇女；(3)自身免疫性疾病患者；(4)精神障碍患者；(5)严重的心、脑、肾功能障碍患者；(6)恶性肿瘤患者。另选取同期体检健康者120例作为对照组，其中男60例，女60例，年龄38～57岁，平均(44.82±1.89)岁；平均BMI为(24.01±1.99)kg/m2，排除标准：(1)HBV阳性指标者；(2)哺乳期或妊娠期妇女；(3)自身免疫性疾病；(4)精神障碍患者；(5)严重的心、脑、肾功能障碍患者；(6)恶性肿瘤患者。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者均签署知情同意书，并经本院医学伦理委员会论证通过。

1.2方法

1.2.1治疗方法 所有患者均采取富马酸替诺福韦二吡呋酯片(成都倍特药业股份有限公司，国药准字： H20163436,每日1次，每次300 mg)联合恩替卡韦(安徽贝克生物制药有限公司，国药准字H20100019；每日1次，每次0.25 mg)治疗，共治疗6个月。治疗结束后每3个月对患者进行定期随访，随访结束日期为2021年11月1日。随访指标包括肝功能检测、HBV-DNA、HBsAg和乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的检测,根据结果统计术后HBV复发率。患者的治疗效果评价标准：治疗后患者的肝功能指标恢复正常状态，HBV-DNA含量下降到<1 000 copy/mL则为显效；治疗后患者的肝功能指标明显恢复，HBV-DNA含量较治疗前降低值>2 000 copy/mL则为有效；治疗后患者的肝功能指标无显著变化，与治疗前相比，HBV-DNA含量降低值<2 000 copy/mL则为无效。本研究中以120例HBV治疗患者中显效以及有效作为治疗有效组，以无效作为治疗无效组[5]。

1.2.2miR-125b-5p、miR-122-3p检测 分别于治疗前以及治疗6个月后进行静脉采血4 mL，3 500 r/min离心15 min后分离血清，以Trizol试剂(TIANGEN,中国)进行总RNA提取，采用7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行扩增，miR-125b-5p上游引物：5′-TTA TTG GGT GTT GTA TT-3′，miR-125b-5p下游引物：5′-TTG TAG GGT TTG AGG TAT TT-3′，miR-122-3p上游引物：5′-GTA TTG GAT ATG ATT GAT TAT G-3′，miR-122-3p下游引物：5′-TAG TGT AGG GTT TGA GG-3′，以U6作为内参基因，U6上游引物，5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。反应条件设定为95 ℃下5 min，95 ℃下40 s，60 ℃下20 s，72 ℃下15 s，共计完成40个循环。使用2-ΔΔCt计算miR-125b-5p、miR-122-3p水平，ΔCt=各组目的基因Ct值-组内相应内参的Ct值，ΔΔCt=实验ΔCt-对照ΔCt。

1.2.3肝功能检测 采集所有患者静脉血4 mL，3 500 r/min离心15 min后分离血清，采用全自动生化分析仪combas701检测肝功能丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平。ALT、AST和AST检测试剂盒购于南京Boxbio生物科技有限公司，所有操作均按照说明书严格操作。

1.2.4免疫指标检测 使用流式细胞仪(FACSCalibur)对两组患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平进行检测；使用全自动免疫分析仪combas801对两组患者的IgA、IgM、IgG进行检测。CD3+、CD4+、CD8+抗体购于赛默飞世尔公司；IgA、IgM、IgG检测试剂盒购于南京Boxbio生物科技有限公司，所有操作均按照说明书严格操作。

2 结 果

2.1病例组与对照组的miR-125b-5p、miR-122-3p水平比较 病例组miR-125b-5p、miR-122-3p水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 病例组与对照组miR-125b-5p、miR-122-3p水平比较

2.2病例组与对照组的肝功能比较 病例组TBIL、ALT、AST均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 病例组与对照组的肝功能比较

2.3病例组与对照组的免疫功能比较 病例组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 病例组与对照组的免疫功能比较

2.4不同治疗效果的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平比较 经过富马酸替诺福韦二吡呋酯片联合恩替卡韦治疗后，无效组的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平均显著高于有效组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同治疗效果患者的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平比较

2.5不同治疗效果患者的肝功能比较 富马酸替诺福韦二吡呋酯片联合恩替卡韦治疗后，无效组患者的TBIL、ALT、AST显著高于有效组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 不同治疗效果患者的肝功能比较

2.6不同治疗效果患者的免疫功能比较 富马酸替诺福韦二吡呋酯片联合恩替卡韦治疗后，无效组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG显著低于有效组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 不同效果患者的免疫功能比较

2.7相关性分析 通过对病例组miR-125b-5p、miR-122-3p与肝功能、免疫功能相关性分析，发现miR-125b-5p、miR-122-3p与TBIL、ALT、AST、HBV DNA呈正相关，与CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG呈负相关，见表7。

表7 相关性分析

2.8miR-125b-5p、miR-122-3p两指标联合检测价值分析 miR-125b-5p、miR-122-3p对于患者治疗无效预测的特异度显著高于单独检测，且经ROC曲线分析，两指标联合检测对于无效患者的预测ROC曲线下面积显著高于单独检测，且miR-125b-5p、miR-122-3p最佳临界值分别为2.41，2.55(2-ΔΔCt)。见表8和图1。

表8 miR-125b-5p、miR-122-3p两指标联合检测价值分析

图1 ROC曲线分析

3 讨 论

人体感染HBV后，microRNA可受到损伤，分解后进入血液循环，其形态较为稳定[6]。有研究显示，microRNA参与了肝细胞的炎症反应以及氧化应激反应过程，因此检测HBV患者的microRNA，对于探索疾病进展以及治疗效果具有积极的意义[7]。

在本研究中，通过对HBV患者的miR-125b-5p、miR-122-3p水平分析，发现HBV患者体内miR-125b-5p、miR-122-3p水平高于健康人群，且随着HBV患者治疗效果的好转呈现下降趋势。miR-122-3p主要来源于人体的18号染色体。研究证明[8]，miR-122-3p在HBV感染过程中发挥重要的作用，在huh7肝细胞中miR-122-3p表达呈现上升趋势，同时miR-122-3p与HBV的复制相关[8]。有研究发现，miR-122-3p可与HBV RNA非编码区的59号位点相结合，进一步促进病毒的复制[9]。miR-122-3p还可以增加HBV的稳定性，在一定程度上促进疾病的进展。罗丹等[10]通过对HBV患者的疾病进展进行研究，发现患者的疾病进展与miR-122-3p呈现显著的相关性，与本研究结果一致。

miR-125b-5p可通过抑制肝细胞内病毒的复制能力来降低病毒的感染作用[11]，而随着患者肝细胞的损伤，细胞内的miR-125b-5p释放到血清中，呈现随疾病进展逐渐上升的趋势。有学者在对HBV感染患者的疾病进展研究中发现，随着肝硬化程度恶化，细胞内的miR-125b-5p水平显著下降，外周血中的miR-125b-5p呈上升趋势[12]，与本研究结果一致。同时也有研究指出，miR-125b-5p还可抑制机体的wnt信号通路，进一步降低局部病灶部位的炎症反应以及氧化应激反应，在一定程度上降低HBV疾病的进展[8,13-14]。在对患者的肝功能以及免疫功能的分析中，患者的miR-125b-5p、miR-122-3p与机体的肝功能以及免疫功能相关，验证了miR-125b-5p、miR-122-3p对于机体的炎症反应以及氧化应激反应的预测。

此外，本文分析了患者的miR-125b-5p、miR-122-3p两指标联合检测的效能，发现联合检测的特异度优于单独检测，两指标联合检测ROC曲线下面积显著高于单独检测，且获得miR-125b-5p、miR-122-3p最佳临界值，可在一定程度上对治疗效果进行分析，及早对治疗效果进行预测。

综上所述，miR-125b-5p、miR-122-3p的表达水平与HBV患者肝功能、免疫功能显著相关，miR-125b-5p、miR-122-3p对HBV的治疗效果具有预测价值。但是本研究还存在一定的局限性，由于纳入的样本量较小，还需在后期临床研究中进行验证。