伍玥 祁亚宾 张延瑞 朱文亮 周胜理 丁松泽

(河南省人民医院 1消化内科，河南 郑州 450000；2重症医学科；3病理科)

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，是一种下咽至食管胃结合之间来源于食管上皮的癌症，主要表现为进行性吞咽困难、背痛、胸骨后疼痛等〔1,2〕。我国食管癌发生率位于世界前列，且随着发展带来的环境问题，导致食管癌发生率呈上升趋势，中老年人、饮食不良者、有恶性肿瘤家族史者为食管癌的高发人群，食管癌晚期死亡率高、预后差，严重威胁患者健康〔3～5〕。及早发现并干预治疗对提高食管癌患者预后意义重大。大蒜素是从大蒜中提取的有机硫化合物，是一种广谱抗菌药，具有消炎、降血脂、抑制癌细胞的作用〔6,7〕。本文分析大蒜素对食管癌模型大鼠Wnt/β-catenin通路的影响，旨在探讨食管癌是否通过Wnt/β-catenin通路干预食管癌的发生发展。

1 材料与方法

1.1材料 选取60只健康雄性大鼠〔北京北生研生物制品有限公司，使用许可证号：SYXK(京)2016-0051〕，鼠龄10～12 w，平均(8.6±1.2)w；体重320～343 g，平均(227.9±9.6)g。所有大鼠于(21.6±2.4)℃环境中适应性喂养1 w。本研究获河南省人民医院伦理委员会批准。主要试剂：兔抗大鼠细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)抗体(Gibco公司)；小鼠抗大鼠鳞状细胞癌抗原(SCCAg)抗体(Invitrogen公司)；兔抗大鼠SCCAg、内参CAPDH抗体(Selleck公司)；小鼠抗兔CD3+抗体(Sigma公司)；大鼠抗小鼠CD4+(BD公司)；小鼠抗兔CD8+抗体(Dako公司)；大鼠抗小鼠Wnt5a、β-连环蛋白(catenin)抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2建模及分组 60只健康雄性大鼠，随机选取15只为正常组，其余45只建立食管癌大鼠模型，大鼠颈背部皮下注射甲基苄基亚硝胺(NMBA)，10 mg/kg，2次/w，连续干预18 w，大鼠瘤体总体积大于30 mm3说明建模成功，最终43只大鼠建模成功，随机分为模型组15只，低剂量组、高剂量组各14只，低剂量组大鼠给予10 mg/kg大蒜素灌胃处理，高剂量组给予20 mg/kg大蒜素灌胃处理，正常组、模型组不做处理，连续干预10 w，观察效果。

1.3指标检测

1.3.1大鼠病理改变观察 取各组大鼠静脉血4 ml,3 000 r/min离心10 min，离心半径5 cm，-29℃保存。麻醉各组大鼠后断颈处死，剥离食管组织，记录肿瘤发生情况，游标卡尺测量瘤体长径(a)、短径(b)，计算瘤体总体积(V)，V=ab2π/6；观察并记录体积大于1 mm3的瘤体个数，并称取瘤体总质量。将剥离的食管组织，4%甲醛中固定，石蜡包埋保存，以便后续检测。

1.3.2苏木素-伊红(HE)染色 取出包埋后食管组织标本，流水冲洗20 min，70%、90%、100%酒精脱水5 min，二甲苯透明，切片，温水烫平，烘干，二甲苯脱蜡10 min，100%、90%、70%酒精覆水各5 min，流水冲洗15 min，苏木素染色3 min，乙酸分化1 min，流水冲洗5 min，反蓝，伊红染色1 min，70%、90%、100%酒精脱水15 s，二甲苯1 min，自然风干，滴中性树胶封片，置于光学显微镜下(北京中西远大科技有限公司，型号：TS2009)观察其食管组织病理学变化。

1.3.3酶联免疫吸附试验检测肿瘤标志物水平 酶标板每孔加稀释后的待测血清50 μl，封孔，恒温静置60 min，弃反应液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，每孔加生物素化工作液20 μl，封孔，恒温静置30 min，洗涤，每孔加酶标抗体20 μl，恒温静置30 min，加显色剂，避光显色10 min，加底物液，酶联免疫试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)检测CYFRA21-1、癌胚抗原(CEA)、SCCAg水平。

1.3.4流式细胞仪检测免疫功能指标 待测的标本做抗凝处理，分为待测管和标准管，待测管分别加入CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体，标准管加入标准液，室温孵育40 min，加溶血剂，待完全溶血后，离心，弃上清，洗涤，加固定剂，加仪器缓冲液用以悬浮细胞，流式细胞仪(广州吉源生物科技有限公司，型号：CyFlow Cube6)检测CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.5Western印迹检测Wnt/β-catenin通路蛋白表达量 电泳上样缓冲液裂解细胞，收集蛋白样品，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，硝酸纤维素(NC)膜转膜，洗涤液漂洗2 min，加Western封闭液封闭60 min，1∶1 000稀释一抗并添加，4℃孵育过夜，回收一抗，洗涤，1∶1 000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗并添加，室温孵育60 min,洗涤，显色、成像，检测Wnt5a、β-catenin相对表达量。

1.4统计学处理 采用SPSS25.0软件进行重读测量方差分析、方差齐性检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组食管组织病理学观察 如图1所示，正常组食管组织未见异常，黏膜平整光滑；模型组食管组织变粗，食管黏膜粗糙，管腔狭窄，黏膜层出现乳突瘤样改变；低剂量组、高剂量组食管黏膜较平整光滑，管腔狭窄明显改善。

2.2各组肿瘤生长情况比较 与模型组相比，低剂量组、高剂量组瘤体总体积、瘤体总质量、瘤体个数较少，具有统计学差异(P<0.05)；与低剂量组相比，高剂量组瘤体总体积、瘤体总质量、瘤体个数较少，具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

图1 各组食管组织病理学(HE染色，×200)

2.3各组肿瘤标志物水平比较 与正常组相比，其他3组CYFRA21-1、CEA、SCCAg水平显著较高(P<0.05)；与模型组相比，低剂量组、高剂量组CYFRA21-1、CEA、SCCAg水平显著较低(P<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组CYFRA21-1、CEA、SCCAg水平显著较低(P<0.05)。见表2。

2.4各组免疫功能比较 如表3所示，与正常组相比，其他3组CD3+、CD4+水平较低，CD8+水平较高，具有统计学差异(P<0.05)；与模型组相比，低剂量组、高剂量组大鼠CD3+、CD4+水平较高，CD8+水平较低，具有统计学差异(P<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组大鼠CD3+、CD4+水平较高，CD8+水平较低，具有统计学差异(P<0.05)。

2.5各组Wnt/β-catenin通路蛋白表达对比 如表3、图2所示，与正常组相比，其他3组Wnt5a、β-catenin表达较高，具有统计学差异(P<0.05)；与模型组相比，低剂量组、高剂量组Wnt5a、β-catenin表达较低，具有统计学差异(P<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组Wnt5a、β-catenin表达较低，具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组肿瘤生长情况比较

表2 各组肿瘤标志物水平比较

表3 各组免疫功能及Wnt/β-catenin通路蛋白表达比较

1～4：正常组，模型组，低剂量组，高剂量组图2 Wnt/β-catenin通路蛋白表达

3 讨 论

食管癌为常见的恶性肿瘤，有研究发现，食管癌病因复杂，与年龄、职业、种族、生活环境、饮食习惯、遗传等因素均有一定相关性，具有临床发现晚、恶性程度高的特点〔8,9〕。我国每年食管癌的发病率占全世界发病率的一半，且食管癌5年生存率较低〔10〕。细胞增殖失控是肿瘤的基本特征，故抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤凋亡具有重要作用〔11〕。

大蒜素是多种有机硫化物的复合体，具有抗炎、抗溃疡、降血糖血脂、抗肿瘤等多种药理学作用〔12〕。有研究显示，大蒜素可抑制多种癌症，如食管癌、胃癌等，可能与大蒜素可通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)8、外源凋亡通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路活性，抑制食管癌细胞及胃癌细胞的增殖，促进癌细胞的凋亡相关〔13,14〕。相关研究显示，老年食管癌患者使用复方苦参注射液+放化疗，CEA、糖类抗原(CA)125等肿瘤标志物水平明显下降，CD3+、CD4+水平明显提升，可能是复方苦参注射液主要由苦参、白土苓、首乌等中草药中提取，具有凉血解毒、抗癌的功效，其有效成分可阻断内皮及肿瘤细胞黏附、抑制肿瘤细胞转移，激活T淋巴细胞活性，放化疗可抑制肿瘤细胞增殖，二者联合可有效杀灭肿瘤细胞，改善肿瘤标志物水平，提高免疫力〔15〕。还有研究发现，食管癌晚期大鼠经大蒜素干预后，食管内瘤体总质量、瘤体个数明显减少，可能是大蒜素可抑制癌细胞增殖，清除自由基，缓解氧化应激损伤，抑制食管黏膜病变，效果显著〔16〕。本文研究结果表明，经大蒜素处理后，食管癌大鼠肿瘤生长情况、肿瘤标志物水平得到改善，免疫功能得到调节，从而使食管黏膜细胞损伤降低，抑制食管组织进一步损伤，促进食管功能的修复。

Wnt/β-catenin通路是生物进化过程中较保守的通路，可调控细胞的分化、增殖、发育及肿瘤发展，另在血管生成中有重要作用〔17〕。Wnt5a属于Wnt蛋白家族，是一种分泌性糖蛋白，可调控多种细胞功能；β-catenin是一种黏膜因子，主要位于细胞膜，具有活化靶细胞的功效〔18,19〕。食管鳞癌患者中，β-catenin、淋巴细胞结合增强因子(LEF)1表达升高，且随着病情加重，β-catenin、LEF1表达随之升高，二者表达与分化程度、浸润深度相关〔20〕。还有学者研究发现，食管癌患者Wnt5a、β-catenin表达较高，经白藜芦醇干预后，Wnt5a、β-catenin表达降低，可能是白藜芦醇可抑制Wnt/β-catenin通路活性，抑制Wnt5a、β-catenin表达，从而抑制食管癌细胞的增殖，促进食管组织的修复〔21〕。本研究结果表明，大蒜素可能抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白活性，有效阻止食管组织细胞的凋亡，从而起到保护食管的功效。