王慧 杨淼 任慧敏 赵婷婷 韩树池 韩宝华

(河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一类以不完全可逆气流受限为特征的呼吸系统疾病，发病机制尚不十分清楚，临床上主要使用支气管舒张剂及糖皮质激素进行治疗，但病程中会出现急性加重反复发作、气道狭窄进行性加重，最终发展为呼吸衰竭、甚至死亡〔1，2〕。气道内炎症、氧化应激及内质网应激的异常激活与气道狭窄、气道上皮损害的发生密切相关，是目前研究COPD发病机制及防治手段的主要靶点。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是体内广泛存在的丝苏氨酸蛋白激酶，胰岛素抵抗、炎症、氧化应激、缺血缺氧等病理因素能够刺激AMPK磷酸化为p-AMPK，p-AMPK能够起到抗感染、抗氧化应激、抗内质网应激等作用，进而实现对组织和脏器的保护。已有动物实验证实，COPD小鼠肺组织中p-AMPK的表达增加，使用AMPK的激动剂能够减轻COPD小鼠肺组织的炎症、氧化应激及内质网应激〔3，4〕。因此，AMPK是近些年受到越来越多关注的COPD治疗靶点。二甲双胍是临床上治疗糖尿病的常用药物，多项基础研究证实，二甲双胍通过激活AMPK发挥抑制肝糖原输出、增加骨骼肌摄取葡萄糖的作用。有研究在呼吸系统中发现了二甲双胍的治疗价值，王晔等〔5〕证实二甲双胍抑制肺纤维化的作用与激活AMPK有关，Wu等〔6〕证实二甲双胍激活AMPK在急性肺损伤过程中起保护作用，周秋华等〔7〕发现二甲双胍能够降低糖尿病合并COPD患者急性发作的发生率。但二甲双胍治疗COPD是否直接改善肺组织病理改变、是否通过激活AMPK通路发挥COPD的治疗作用尚不清楚，二甲双胍发挥治疗作用的机制也未阐明。本研究以野生型(WT)小鼠和肺AMPK特异性敲除小鼠为对象，探讨二甲双胍调控AMPK通路对稳定期COPD小鼠的影响及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 WT C57BL/6J小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物公司，生产许可SCXK(沪)2018-0006；Sftpc-Cre小鼠(遗传背景C57BL/6J)、AMPKFLOX/+小鼠(遗传背景C57BL/6J)购自上海南方模式生物科技公司。

1.2试剂与仪器 二甲双胍购自Sigma公司，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自上海歌凡生物，RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司，AMPK、p-AMPK、核因子(NF)-κB、核因子E2相关因子(Nrf)2、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12一抗，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8检测试剂盒购自上海西唐公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京检测研究所。长40 cm、宽25 cm、高20 cm自制薰烟箱，正置显微镜为Nikon公司，电泳系统及成像系统为上海天能公司。

1.3肺特异性AMPK基因敲除小鼠的获取 Sftpc-Cre小鼠与AMPKFLOX/+小鼠同笼，获得AMPK+/+Cre+、AMPKFLOX /+Cre+、AMPKFLOX/FLOXCre+的后代小鼠，剪取尾巴末端约0.5cm，采用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，采用北京唯德生物科技有限公司提供的引物对DNA进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，产物为一条带的即为AMPKFLOX/FLOXCre+小鼠，肺内特异性表达的Cre酶可以剪切AMPK两个loxP位点间的序列，进而实现AMPK基因的肺特异性敲除。

1.4动物分组、造模及给药 野生型C57BL/6J小鼠随机分为AMPK-WT组、AMPK-WT+COPD组、AMPK-WT+COPD+二甲双胍组，肺AMPK特异性敲除小鼠随机分为AMPK-敲除(KO)组、AMPK-KO+COPD组、AMPK-KO+COPD+二甲双胍组，每组8只。采用香烟烟雾吸入法制备COPD模型，方法如下：将小鼠放入自制薰烟箱，每周一至周五进行烟雾吸入，2次/d、上午9点开始烟雾吸入、下午3点开始烟雾吸入，每次使用2支香烟，两支香烟烟雾吸入间隔10 min，整个烟雾吸入持续12 w。二甲双胍干预方法如下：COPD造模第7周起，在上午香烟烟雾吸入前1 h给予200 mg/kg二甲双胍腹腔注射，1次/d，连续给药6 w。

1.5标本收集 末次烟雾吸入后24 h处死小鼠，做颈部切开暴露气管，插入灌流针并用1 ml磷酸盐缓冲液进行肺泡灌洗，连续3次，收集肺泡灌洗液(BALF)，4℃、1 500 r/min离心10 min后收集上清，-80℃保存；解剖肺组织，左肺组织用4%多聚甲醛固定后制作蜡块，右肺组织用液氮冷冻后放入-80℃保存。

1.6肺组织病理改变的检测 取肺组织的蜡块，制作病理切片后采用HE染色试剂盒进行染色，在显微镜下观察肺组织病理改变，测量肺泡平均截距(MLI)。

1.7肺组织中p-AMPK、NF-κB、Nrf2、CHOP、Caspase-12检测 取适量液氮冷冻的肺组织，加入RIPA裂解液匀浆，提取肺组织中的蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白含量，取含有20 μg蛋白的样本加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行电泳后电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h，AMPK、p-AMPK、NF-κB、Nrf2、CHOP、Caspase-12一抗4℃孵育PVDF膜过夜。次日，辣根过氧化物酶(HRP)二抗室温孵育PVDF膜1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，根据条带灰度值计算蛋白表达量。

1.8BALF中TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD的检测 取BALF标本，采用试剂盒检测TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD的含量，均按照试剂盒说明书进行操作。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组体重比较 造模第3周起，AMPK-WT+COPD组体重明显低于AMPK-WT组，AMPK-KO+COPD组体重明显低于AMPK-WT+COPD组(P<0.05)；造模第10周起，AMPK-WT+COPD+二甲双胍组体重明显高于AMPK-WT+COPD组，AMPK-KO+COPD+二甲双胍组体重明显低于AMPK-WT+COPD+二甲双胍组(P<0.05)；AMPK-WT组与AMPK-KO组体重无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组体重比较

2.2各组肺组织病理改变 与AMPK-WT组比较，AMPK-WT+COPD组小鼠肺间质内大量炎症细胞浸润、支气管管腔狭窄，MLI明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-WT+COPD+二甲双胍组肺间质内少量炎症细胞浸润、未见明显支气管管腔狭窄，MLI明显降低(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD+二甲双胍组比较，AMPK-KO+COPD+二甲双胍组肺间质内炎症细胞浸润增加、支气管管腔狭窄，MLI明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-KO+COPD组小鼠肺间质内炎症细胞浸润及支气管管腔狭窄均加重，MLI明显增加(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组肺组织病理改变(HE染色，×400)

2.3各组肺组织中p-AMPK表达比较 与AMPK-WT组(1.00±0.0.19)比较，AMPK-WT+COPD组肺组织中p-AMPK的表达水平(1.73±0.20)明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-WT+COPD+二甲双胍组肺组织中p-AMPK的表达水平(2.78±0.42)明显增加(P<0.05)。AMPK-KO组、AMPK-KO+COPD组、AMPK-KO+COPD+二甲双胍组小鼠肺组织中均不表达AMPK及p-AMPK。见图2。

2.4各组AMPK通路下游炎症反应比较 与AMPK-WT组比较，AMPK-WT+COPD组肺组织中NF-κB表达水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-WT+COPD+二甲双胍组肺组织中NF-κB表达水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明显降低(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD+二甲双胍组比较，AMPK-KO+COPD+二甲双胍组肺组织中NF-κB表达水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-KO+COPD组肺组织中NF-κB表达水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8含量均明显增加(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组肺组织MLI、BALF中NF-κB表达及TNF-α、IL-6、IL-8含量比较

1～6：AMPK-WT组、AMPK-WT+COPD组、AMPK-WT+COPD+二甲双胍组、AMPK-KO组、AMPK-KO+COPD组、AMPK-KO+COPD+二甲双胍组；下图同图2 各组肺组织中p-AMPK、AMPK、NF-κB表达

2.5各组AMPK通路下游氧化应激反应比较 与AMPK-WT组比较，AMPK-WT+COPD组肺组织中Nrf2表达水平及BALF中SOD含量均明显降低，BALF中MDA含量明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-WT+COPD+二甲双胍组肺组织中Nrf2表达水平及BALF中SOD含量均明显增加，BALF中MDA含量明显降低(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD+二甲双胍组比较，AMPK-KO+COPD+二甲双胍组肺组织中Nrf2表达水平及BALF中SOD含量均明显降低，BALF中MDA含量明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-KO+COPD组肺组织中Nrf2表达水平及BALF中SOD含量均明显降低，BALF中MDA含量明显增加(P<0.05)。见图3、表3。

图3 各组肺组织中Nrf2的蛋白条带

表3 各组肺组织Nrf2、CHOP、Caspase-12表达和BALF中MDA、SOD含量比较

2.6各组肺组织中AMPK通路下游内质网应激比较 与AMPK-WT组比较，AMPK-WT+COPD组肺组织中CHOP、Caspase-12表达水平明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-WT+COPD+二甲双胍组肺组织中CHOP、Caspase-12表达水平明显降低(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD+二甲双胍组比较，AMPK-KO+COPD+二甲双胍组肺组织中CHOP、Caspase-12表达水平明显增加(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-KO+COPD组肺组织中CHOP、Caspase-12表达水平明显增加(P<0.05)。见表3、图4。

图4 各组肺组织中CHOP、Caspase-12表达

3 讨 论

COPD的发病机制复杂，气流受限及气道重塑不完全可逆，目前临床治疗以对症为主，尚缺乏能够纠正气流受限及气道重塑的有效药物。有临床研究报道，二甲双胍治疗糖尿病合并COPD能够改善预后、降低急性发作发生率并提高远期生存率〔7〕。香烟烟雾吸入是目前建立COPD动物模型的常用方法，本研究结果表明二甲双胍对COPD具有治疗价值。

二甲双胍目前主要用于糖尿病治疗，能够激活AMPK通路并调节能量代谢、增加胰岛素敏感性〔8,9〕。外界炎症、氧化应激、缺血缺氧等病理因素刺激AMPK发生磷酸化后能够发挥抗炎、抗氧化、抗内质网应激等作用，是机体自我保护的重要代偿机制〔10,11〕。多项COPD的研究证实，COPD小鼠肺组织中p-AMPK的表达增多且AMPK激活剂能够减轻COPD的病理改变〔3,4，12〕，表明AMPK的激活在COPD发病中起保护作用。本研究提示二甲双胍改善COPD病理改变的作用可能与激活AMPK有关。

为了验证AMPK在COPD发病及二甲双胍治疗COPD中的作用，本研究采用LoxP-Cre技术对肺AMPK进行了特异性敲除，结果表明AMPK在COPD发病中起保护作用，敲除AMPK会使COPD的病理改变加重。在AMPK敲除小鼠建立COPD的过程中给予二甲双胍干预，肺组织的病理改变有所改善，但是这一改善作用与二甲双胍用于野生型COPD小鼠治疗比较明显减弱，即敲除AMPK削弱了二甲双胍改善COPD病理改变的作用，表明二甲双胍改善COPD病理改变的作用与激活AMPK有关。

AMPK发生磷酸化后抗感染作用与抑制NF-κB通路及下游TNF-α、IL-6、IL-8细胞因子的生成有关〔13，14〕，抗氧化应激作用与增强Nrf2通路、增加抗氧化酶SOD生成有关〔3，15〕，抗内质网应激作用与抑制CHOP通路及下游Caspase-3表达有关〔4，12〕。炎症、氧化应激及内质网应激在COPD的发病中起重要作用，既往其他研究〔16～18〕及本研究均表明二甲双胍在COPD的治疗中发挥抗炎、抗氧化应激、抗内质网应激作用，与其激活AMPK的作用吻合。在敲除AMPK后，COPD小鼠肺组织中NF-κB、Nrf2、CHOP通路表达异常加剧，二甲双胍抑制COPD小鼠炎症、氧化应激及内质网应激的作用发生逆转。综上，二甲双胍治疗香烟烟雾吸入诱导COPD小鼠能够改善肺组织病理改变并抑制肺组织炎症、氧化应激及内质网应激；AMPK在COPD发病及二甲双胍治疗COPD中起重要作用，特异性敲除肺AMPK后COPD小鼠肺组织病理改变及炎症、氧化应激、内质网应激均加重，二甲双胍治疗作用减弱或消失。